Ремонт коробки ваз: Доступ с вашего IP-адреса временно ограничен — Авито

Содержание

Ремонт КПП ВАЗ – лучшая цена. КПП ВАЗ – ремонт и диагностика с Техно-Сервис К

Обслуживание и ремонт КПП ВАЗ или автомобиля ЗАЗ — эти услуги у нас всегда доступны. Мы работаем как с зарубежными, так и с отечественными авто. Работы проводятся опытными специалистами на современном оборудовании с использованием оригинальных запчастей и комплектующих.

Любые манипуляции с коробкой переключения передач начинаем с диагностики:

  1. Сначала мы проводим визуальный осмотр: проверяем уровень и качество масла, рабочей жидкости, и есть ли дефекты.
  2. Пробный заезд — оцениваем функциональное состояние КП и каждый режим работы.
  3. Компьютерная диагностика. Подключаем компьютер, считывающий коды ошибок.

После тщательной проверки трансмиссии проводим ремонт КПП: цена будет разумной и в качестве не возникнет сомнений. Стоимость, варианты ремонтных работ и запчасти — все это обязательно с вами согласуем.

Ремонт КПП ВАЗ

На отечественных авто ВАЗ в основном стоят механические коробки передач, которые нуждаются в регулярном обслуживании. Если во время диагностики обнаруживаются неисправности, их нужно устранять сразу. Это недорого: на ремонт КПП ВАЗ цена невысокая, во всяком случае, намного ниже, чем покупка новой коробки передач.

Длительность ремонтных работ зависит от тяжести поломки, но мы сделаем все возможное для быстрого восстановления коробки. Для этого у нас есть многолетний опыт и необходимое оборудование.

Ремонт КПП ЗАЗ

Механическая трансмиссия ЗАЗа может выйти из строя, как по искусственным, так и по естественным причинам. Для увеличения ее эксплуатационного периода важно регулярно проходить ТО.

Если возникло подозрение на неисправность, обязательно выполните ремонт КПП ЗАЗ — услуга предоставляется недорого в «Техно-Сервис К». Первым делом мы проведем диагностику. Демонтаж и разборка коробки не всегда необходимы, но если поломка серьезная, тогда мы:

  1. Демонтируем узел и разберем его.
  2. Промоем детали и заменим масло.
  3. Восстановим или заменим отдельные детали.
  4. Выполним сборку.
  5. Установим и обкатаем механизм.

Все эти процедуры мы выполняем быстро. На проведенные работы предоставляем гарантию.

Ремонтировать КПП у нас — это выгодно

Почему? Мы всегда нацелены на требуемый результат. В процессе работы используем только оригинальные запчасти и применяем узкоспециализированное оборудование. Поврежденную деталь можем принять на ремонт в то время, когда будет удобно именно вам.

Мы работаем с коробками подключения передач любого типа. Проводим ремонт КПП в Симферополе — обращайтесь в любой наш дилерский центр. Звоните и записывайтесь на сервис или просто пишите нам, и мы свяжемся с вами в течение нескольких минут.

КПП ВАЗ Екатеринбург | Ремонт КПП ВАЗ Екатеринбург

ЧАСТЫЕ НЕИСПРАВНОСТИ КПП ВАЗ

Мы занимаемся восстановлением и ремонтом КПП ВАЗ и ГАЗ уже не первый год и потому составили свой перечень самых частых неисправностей у коробок передач ВАЗ. Надеемся, вам это поможет продиагностировать свою проблему и, хоть приблизительно, оценить стоимость ее устранения. Кроме того вы в любой момент можете спросить совета лично у нашего мастера по указанному выше телефону.

*Примерная стоимость - это минимальные затраты на покупку запчастей в розничных магазинах, без учета услуг по замене этих запчастей, снятия-установки КПП. В нашем сервисе эти запчасти обойдутся вам дешевле, чем в магазинах.

        2110, 2111, 2112, Калина, Приора
 

Признаки: сильный шум при езде, плохо включаются передачи, особенно 1 и 2.

 

Симптом: обрывает вторичный вал, т.к. вал внутри полый, тонкий.

Для КПП десятой серии АвтоВАЗ разработал новый вал, внутри которого для смазки шестерен использована полая конструкция. Поэтому вал тоньше, и, часто, у основания переламывается (по стопорному кольцу).

 

Последствия: вал смещается, давит на вилку и вилка загибает штока 1, 2, 3, 4 (реже 5) передач и выламывает посадочное место штока на корпусе КПП.

 

Запчасти под замену: вал, штока, подшипники, корпус (или на сварку – зависит от тяжести повреждений).

 

Примерная стоимость*: 4500-9000 р.

 

Признаки: во время езды происходит хлопок-толчок – при переключении передач машина не разгоняется, масло вытекает.

 

Симптом: разрыв сателлита.

Во всех переднеприводных коробках ВАЗ использован планетарный механизм дифференциала, который был разработан для «девятой» серии ВАЗов, но не адаптирован под «десятую». Маленький сателлит разрывает из-за бОльшей на него нагрузки по сравнению с «девятой» серией. Особенно часто это происходит в автомобилях с ABS (Калина, Приора)

 

Последствия: при разрывании сателлит пробивает корпус

 

Запчасти под замену: планетарный механизм, корпус , иногда шток выбора передач.

 

Примерная стоимость: 3000-7500 р.

        2108, 2109, 2113, 2114, 2115
 

Признаки: сильный вой на пятой, шум на холостом, туго включаются передачи

 

Симптом: рассыпается подшипник пятой передачи.

Конструкция маслоналивной горловины не позволяет наливать масла с запасом, а отсутствие щупа – делает невозможным контроль его объема. При уменьшенном  количестве масла пятая передача испытывает масляное голодание и в ней рассыпается подшипник.

 

Последствия: сгорает пятая передача.

 

Запчасти под замену: шестерня пятой передачи в сборе, игольчатый подшипник, втулка игольчатого подшипника, подшипники и прижимная пластина подшипников первичного и вторичного валов.

 

Примерная стоимость: 2500 р.

        Все модели ВАЗ
 

 

Признаки:

1. Износ подшипников первичного вала: шум (потрескивание, пощелкивание) на холостом, при нажатом сцеплении шум пропадает.

2. Износ подшипников первичного вала: шум на ходу, на всех передачах, чем выше передача – тем выше шум

 

Симптом: износ подшипников

 

Запчасти под замену: комплект подшипников, в худшем случае при разрыве подшипников повреждается прижимная пластина подшипников или корпус КПП

 

Примерная стоимость:  1000 р. 

 

Признаки: хруст при включении передачи

 

Симптом: износ синхронизатора

 

Последствия: если своевременно не заменить, то передача начнет вылетать и запчасти для ремонта обойдутся дороже.

 

Запчасти под замену: синхронизатор

Примерная стоимость запчастей:  400 р.

 

Признаки: вылетает передача

 

Симптом: износ шестерней. Из-за своевременно неустраненного износа синхронизатора на шестерни оказывается большая нагрузка и они так же следом изнашиваются

 

Запчасти под замену: шестерня, муфта, синхронизатор

 

Примерная стоимость: 2500 р.

 

Признаки: болтается ручка переключения передач вправо-влево, не фиксируется по центру

 

Симптом: ломается пополам пружинка механизма выбора

 

Последствия: часто путаются передачи

Запчасти под замену: пружинка механизма выбора

 

Примерная стоимость: 50 р., однако стоимость работ по ее замене значительно дороже, поэтому (если деффект не доставляет сильного дискомфорта) рекомендуется заменить пружинку позже вместе с более серьезными поломками.

Ремонт коробки передач (МКПП) ВАЗ (LADA) 2110 в Москве

Своевременное профессиональное устранение неполадок МКПП Лада 2110 позволит избежать серьезных повреждений агрегата. В нашей компании специальное современное оборудование для компьютерной диагностики состояния коробки передач, которое позволяет определить неисправность еще до снятия агрегата с машины. Благодаря компьютерному определению неполадок и опыту наших механиков, часть неисправностей удается устранить без снятия коробки с машины, а значит уменьшить стоимость ремонта. 

Этапы работы с коробкой передач 

Обнаружив первые признаки неисправности в МКПП, поспешите в наш автосервис. Чем раньше вы обратитесь к специалисту, тем более низкой будет цена ремонта. Неисправность одного узла агрегата приводит к быстрому износу остальных. Учитывая, что первые признаки неполадок появляются тогда, когда степень повреждения достигает критического уровня, нужно оперативно отогнать машину профессионалам, если вы заметите:

  • посторонние звуки при ремонте коробки;
  • заедание при переключении передач;
  • выскакивание рычага.

Устранение неполадок любой сложности в нашем автосервисе возможно в течение дня, потому что:

  • наши специалисты более 10 лет работают с ВАЗ и знают в тонкостях особенности ремонта коробки;
  • на складе всегда есть в запасе комплектующие для МКПП этой марки;
  • если ремонт будет невозможен или нецелесообразен, мы предложим новый узел из имеющихся в наличии на складе в Москве.
  • Обратившись в наш автосервис, вы будете уверены, что заберете исправный автомобиль.

Мы оказываем услуги быстро и недорого. Сколько стоит ремонт, определим совместно с вами, предложив несколько вариантов, разных по цене и глубине воздействия на узел. Мастер понятно изложит подробности каждого варианта, и вы сможете принять взвешенное решение. 

Замена масла МКПП LADA (ВАЗ) 2110 

Чтобы не пришлось ремонтировать коробку чаще, чем положено, своевременно проводите техническое обслуживание узла. Менять масло стоит каждый 6000 километров пробега. Специалисты утверждают, что составы проверенных производителей делают работу коробки более легкой и мягкой. Вы можете выбрать предпочитаемый вариант из широкого ассортимента, имеющихся в нашей мастерской. Мы профессионально заменим масло и предложим компьютерную диагностику состояния коробки. Своевременно устраняя даже мелкие дефекты, вы сможете поддерживать агрегат в работоспособном состоянии долгие годы. Звоните нашему менеджеру, и укажите время, когда вам будет удобно подъехать в один из наших автосервисов.

Ремонт МКПП ВАЗ 2110, замена подшипников вторичного вала, шум из механической коробки при движении

Цены на ремонт КПП (коробки передач)

Срок выполнения работ: от 45 минут

Сеть автосервисов «Ровелс» приглашает на диагностику и ремонт коробок передач. Мы обслуживаем транспортные средства европейских, американских и китайских марок, устраняем неисправности разной сложности от замены масла до капремонта двигателя. На все работы, которые выполнены в нашей сети, действует официальная гарантия.

Причины поломки коробки передач

Все детали транспортного средства подвергаются износу — исключением не стала и коробка передач. У каждой марки и модели авто свой ресурс, в среднем, он составляет 100–120 тыс. км пробега. Но неисправности могут появиться раньше, и необязательно из-за ошибок водителя, к примеру, нерегулярного техобслуживания или езды на непрогретом авто. Езда по пробкам не менее губительна для КПП, чем резкие старты и торможения.

Главные причины поломок:
  • Неверный выбор передач при движении
  • Резкие ускорения и торможения, агрессивная манера вождения
  • Буксование, езда в пробках, высокая температура воздуха на улице, буксировка другого транспортного средства и прочие действия, которые способствуют регулярному перегреву коробки передач
  • Езда на непрогретом авто в холодное время года
  • Нерегулярное техобслуживание авто
  • Механические повреждения

Регулярное техобслуживание, прогрев авто по утрам, аккуратная езда, щадящий режим эксплуатации продлят срок службы коробки передач. Избегайте резких стартов и торможений, ошибок в переключении, буксировки, перевозки тяжелых грузов. В некоторых случаях ремонт КПП — дорогое «удовольствие», и дешевле предупредить проблему, чем устранить ее.

Как понять, что нужен ремонт коробки передач

Безопасность на дороге зависит от технического состояния авто. Не все поломки видны при визуальном осмотре, некоторые из них проявляют себя в самый неподходящий момент — во время движения по городу, в поездке к дальним родственникам или командировке. Верный способ избежать ДТП — прислушаться к своему авто, и при первых признаках поломки ехать на диагностику. Чем раньше вы приедете на автосервис, тем дешевле обойдется ремонт транспортного средства.

В каких случаях требуется диагностика:

  • Доносится шум из КПП
  • Авто начинает пробуксовывать
  • Стало трудно переключать передачи
  • Перестала работать какая-то из передач
  • Передачи самопроизвольно переключаются
  • Появилась вибрация рычага КПП

Диагностика и ремонт в КПП в Санкт-Петербурге

Мы выполняем полный комплекс работ по техобслуживанию транспортных средств. Автосервисы сети «Ровелс» укомплектованы всем необходимым для диагностики и ремонта: подъемники, стенды и прочее оборудование. У нас работают специалисты с большим опытом ремонта авто иностранных и отечественных марок. На складе в наличие большой выбор запчастей, комплектующих и расходников для ремонта транспортных средств.

Диагностика коробки передач включает проверку: уровня масла, шестерней и валов, целостности корпуса, наличия посторонних шумов и подтеков трансмиссионного масла, герметичности и степени износа сальников, состояния синхронизаторов и вилок выбора передач, работоспособности подшипников. От точности диагностики зависит исправность авто — нет смысла устранять поломку там, где ее нет, и чинить то, что не нуждается в ремонте. Проверка выполняется как на ходу, так и на подъемнике.

Ремонт КПП включает:
  • Демонтаж коробки передач
  • Разборку агрегата транспортного средства
  • Дефектовку узлов, устранение неисправностей
  • Сборку КПП, установку на авто
  • Регулировку

Как записаться на техобслуживание

Автосервисы «Ровелс» работают в Кировском, Выборгском, Петроградском, Невском районах города. Адреса и карты проезда указаны на нашем сайте — выберите СТО, на котором вам будет удобно обслуживаться. Чтобы не тратить время на ожидание в очереди, запишитесь на сервис по телефону. Специалисты подготовят запчасти и расходники, которые могут понадобиться для обслуживания вашего транспортного средства.

Хотите проверить или отремонтировать свой автомобиль?

Оставьте контакты — мы перезвоним и ответим на все вопросы.

Каждый из автосервисов укомплектован современным оборудованием, авто обслуживают специалисты с большим стажем работы. На автосервисах предусмотрены комнаты для клиентов с Wi-Fi — пока ваше авто будут ремонтировать, вы отдохнете, ответите на рабочую почту и звонки.

Больше информации по телефону (812) 424-82-34. Звоните — специалисты автосервисов ответят на ваши вопросы.

Ремонт КПП и замену сцепления автомобилей ВАЗ

Коробка передач в автомобилях ВАЗ является составляющей трансмиссии транспортного средства, которая предназначена для передачи оптимального значения крутящего момента на выходном валу при любых оборотах. Принцип её работы основан на соединении входного и выходного валов за счёт комбинации шестерён с разными передаточными числами.

При нарушении правил эксплуатации, а также вследствие физического износа деталей коробка передач в автомобилях ВАЗ может сбоить. Так, чаще всего ремонтные работы связаны с заменой подшипников, синхронизаторов или шестерён, а также снижением уровня масла вследствие его вытекания. Неисправная коробка передач исключает достаточный уровень комфортности езды и снижает безопасность управления автомобилем, поэтому любые неполадки этого узла должны оперативно устраняться.

N Наименование работ Модель Стоимость
1 С/у коробку передач 01-07 2000
2 С/у коробку передач 08-099 2000
3 Ремонт коробки   5000
4 Диск сцепления со снятием коробки 01-07 2500
5 Диск сцепления со снятием коробки 08-099 2500
6 Диск сцепления со снятием коробки 2121 4000
7 Маховик с/у при снятой КПП и сцеплении   200
8 Трос сцепления 08-099 600
9 Трос спидометра   700
10 Цилиндр привода, выключ. сцепления с/у   500
11 Регулировка свободного хода сцепления   200
12 Прокачка сцепления   200

Ремонт КПП авто в Самаре — цены на ремонт коробок передач

Компания «Альянс плюс» предлагает диагностику и ремонт КПП в Самаре на высокопрофессиональном уровне, с предоставлением обязательной гарантии. Если в данном узле вашего авто обнаружены неполадки, мы рекомендуем устранить их незамедлительно, так как дальнейшая эксплуатация неисправного КПП может обернуться дорогостоящим ремонтом.

Даже если коробка передач вашей машины обладает большим запасом прочности, привести к ее поломке может ряд факторов, таких как агрессивное вождение с высокими нагрузками на механизм и отсутствие своевременного технического ухода. Ремонт КПП ваз, лада, газ, гранта, приора, калина и других популярных марок, производится нами качественно и в короткий срок.

Следует обратиться к мастерам автосервиса, если появились такие признаки, как:

  • пробуксовка авто на скорости;
  • непонятные рывки при движении;
  • протечки в трансмиссии;
  • медленная реакция при переключении передачи;
  • увеличение расхода топлива.

Качественная диагностика и ремонт КПП

Для того, чтобы понять суть проблемы, специалисты сервиса «Альянс плюс» предварительно диагностируют коробку передач. Помимо визуального контроля механизма, процедура включает определение уровня масла и его состояния, проверку при помощи бортовых систем, контроль давления, проверку датчиков и переключателей, а также функции гидротрансформатора.

Мы осуществляем профессиональный ремонт КПП по доступным ценам. Работы выполняем с применением самого современного оборудования, руками опытных специалистов. Имеем длительный и положительный опыт работы с машинами отечественного и зарубежного производства: производим ремонт КПП kia, skoda, nissan, volkswagen, toyota, hyundai и многих других марок, предоставляем бесплатные консультации нашим клиентам.

Достоинством работы нашей компании является соблюдение всех технических требований производителей к тем или иным маркам автомобилей. Подобный подход обеспечивает 100% гарантию на безупречное дальнейшее функционирование механизма в течение длительного времени.

Цены на ремонт коробок передач в Самаре

Получить консультацию

Оставьте свои контакты и мы вам перезвоним

Сборка и разборка коробки передач Ваз 2110, Ваз 2111, Ваз 2112

Ремонт кпп, руководство по сборке и разборке коробки автомобиля лада 2110, порядок замены сальников своими руками, руководство по ремонту привода ваз 2111, ваз 2112, ваз 2110. Инструкции по ремонту коробки лада 2110. Ремонт сцепления, дифференциал, привода лада 2112

Очищаем от грязи и промываем коробку передач снаружи (не допускайте попадания воды в картер).

Ключом "на 17" отворачиваем болт крепления кронштейна подвески силового агрегата.

Головкой "на 13" отворачиваем шесть гаек крепления задней крышки картера.

Снимаем кронштейн.

Постукивая медным молотком (или обычным через оправку из мягкого металла) по приливам крышки, …

…снимаем ее вместе с уплотнительной прокладкой со шпилек.

Вдавив до упора шток выбора передач, включаем третью передачу или, втянув шток до упора, включаем четвертую.

Накидным ключом "на 10" отворачиваем болт крепления вилки пятой передачи.

Через выколотку из мягкого металла наносим удар по вилке вниз, включая пятую передачу ваз 2110.

Бородком выправляем вмятины гаек первичного и вторичного валов ваз 2111.

Головкой "на 32" с мощным воротком…

…отворачиваем гайки валов.

Поддев отверткой вилку включения пятой передачи, снимаем узел пятой передачи ваз 2112 в сборе.

Вынимаем вилку включения пятой передачи.

Снимаем скользящую муфту синхронизатора со ступицей.

Снимаем блокирующее кольцо синхронизатора ваз 2110.

Вынимаем упорную пластину.

Сдвигаем ступицу внутри скользящей муфты ваз 2112 синхронизатора…

…и вынимаем ступицу, пружины, фиксаторы и сухари синхронизатора пятой передачи.

Медным молотком наносим удар в торец первичного вала ваз 2111.

В образовавшийся зазор между упорной пластиной и ведущей шестерней пятой передачи вставляем две отвертки. Поддевая отвертками шестерню, спрессовываем ее.

Головкой "на 13" отворачиваем три пробки фиксаторов штоков переключения передач.

Вынимаем из гнезд пружины и шарики фиксаторов.

Ударной крестообразной отверткой отворачиваем четыре винта крепления упорной пластины. На винтах имеются специальные стопорные шайбы.

Снимаем упорную пластину.

Двумя отвертками поддеваем упорную шайбу втулки ведомой шестерни пятой передачи.

В образовавшийся зазор между торцом заднего подшипника и упорной шайбой вводим лапы съемника…

…и спрессовываем втулку шестерни ваз 2112 и упорную шайбу.

Двумя отвертками разводим стопорное кольцо на первичном валу…

…и снимаем его.

Таким же образом снимаем стопорное кольцо со вторичного вала ваз 2111.

Головкой "на 13" отворачиваем пробку фиксатора задней передачи и вынимаем пружину.

Вставляем в гнездо фиксатора отвертку и, приложив к ней магнит, извлекаем шарик.

Головкой "на 13" отворачиваем тринадцать гаек и один болт крепления картера коробки ваз 2110 передач к картеру сцепления.

Вставив в паз на стыке привалочных плоскостей картеров отвертку, аккуратно приподнимаем картер коробки…

…и снимаем его.

Накидным ключом "на 10" отворачиваем болт крепления вилки включения I-II передач к штоку.

Приподнимаем шток вверх и выводим вилку из зацепления.

Накидным ключом "на 10" отворачиваем болт крепления вилки включения III-IV передач к штоку.

Отверткой выводим шток из механизма выбора передач.

Поднимаем шток вверх и выводим вилку из проточки скользящей муфты синхронизатора.

Поворачивая шток включения V передачи, выводим его из механизма выбора передач.

Вынимаем ось промежуточной шестерни ваз 2110 заднего хода.

Вынимаем промежуточную шестерню заднего хода.

Вынимаем одновременно первичный и вторичный валы ваз 2111 из роликовых подшипников картера сцепления.

Вынимаем дифференциал в сборе.

Головкой "на 10" отворачиваем три болта крепления механизма выбора передач…

…и снимаем его.

Головкой "на 10" отворачиваем установочный болт рычага выбора передач.

Снимаем рычаг выбора передач со штока.

Поддев отверткой, снимаем защитный чехол штока со втулки.

Вынимаем шток выбора передач.

Заменить шарнир штока выбора передач можно на коробке передач ваз 2112, установленной на автомобиле (снимать шарнир со штока, без необходимости, не следует, т.к. болт крепления установлен на специальном клее ТБ-1324).

Для наглядности проводим эту операцию на снятом штоке.

Накидным ключом "на 10" отворачиваем установочный болт шарнира…

…и снимаем шарнир.

Для замены сальника штока выбора передач поддеваем его крючком из толстой проволоки и извлекаем из втулки.

Отверткой извлекаем из сепаратора ролики переднего подшипника вторичного вала.

Вынимаем сепаратор подшипника.

Зацепив крючком приспособления буртик наружного кольца подшипника, ударами по крючку…

…выпрессовываем кольцо.

Извлекаем маслосборник.

Таким же образом выпрессовываем наружное кольцо подшипника первичного вала.
Вынимаем магнит.

Подходящим отрезком трубы выбиваем из картера сцепления…

…сальник привода.

Через бородок наносим удары в торец наружного кольца подшипика дифференциала…

…и выпрессовываем кольцо.

Таким же образом выбиваем сальник и наружное кольцо подшипника дифференциала из картера коробки передач.
Вынимаем регулировочное кольцо.
Зажимаем первичный вал в тиски с мягкими губками.

Поддеваем двумя монтажными лопатками задний шариковый подшипник и спрессовываем его.

Через оправку наносим удары в торец внутреннего кольца переднего подшипника…

…и спрессовываем кольцо.

Зажимаем в тиски с мягкими губками вторичный вал ваз 2111, ваз 2110, ваз 2112.

Двумя отвертками упираемся в торцы стопорного кольца…

…и снимаем его с переднего конца вала.

В зазор между внутренним кольцом переднего подшипника и торцом ведущей шестерни главной передачи вставляем отвертку и отжимаем кольцо.

В образовавшийся увеличенный зазор вставляем две монтажные лопатки и спрессовываем с вала внутреннее кольцо подшипника.

Захватив трехлапым съемником ведомую шестерню 1-й передачи ваз 2110, ваз 2111, ваз 2112, спрессовываем ведущую шестерню главной передачи.

При отсутствии съемника подкладываем под шестерню упоры и наносим удары медным молотком в торец вала ваз 2112, ваз 2111, ваз 2110.

Снимаем ведущую шестерню главной передачи.

Снимаем ведомую шестерню I передачи.

Снимаем блокирующее кольцо синхронизатора I передачи.

Круглогубцами разводим стопорное кольцо ступицы синхронизатора и снимаем его.

Поддев двумя монтажными лопатками ведомую шестерню II передачи, спрессовываем с вала ступицу скользящей муфты синхронизатора I–II передач.

Снимаем скользящую муфту со ступицей синхронизатора и блокирующее кольцо синхронизатора II передачи.

Снимаем ведомую шестерню II передачи.

Переворачиваем вал в тисках.

Поддев двумя монтажными лопатками задний подшипник вторичного вала, …

…спрессовываем его.

Снимаем упорную шайбу.

Снимаем ведомую шестерню IV передачи.

Снимаем блокирующее кольцо синхронизатора IV передачи.

Круглогубцами разводим стопорное кольцо ступицы синхронизатора…

…и снимаем его.

Захватив трехлапым съемником шестерню III передачи, спрессовываем с вала ступицу скользящей муфты синхронизатора III–IV передач.

При отсутствии съемника подкладываем под шестерню упоры и наносим в торец вала удары медным молотком.

Снимаем скользящую муфту со ступицей синхронизатора.

Снимаем блокирующее кольцо синхронизатора III передачи.

Снимаем шестерню III передачи.

Зажимаем ведомую шестерню главной передачи в тиски с мягкими губками.

Головкой "на 17" отворачиваем восемь болтов крепления шестерни к коробке дифференциала ваз 2111.

Медным молотком выбиваем коробку дифференциала.

Проворачивая, вынимаем шестерни приводов (полуосевые) из коробки.

Зажав коробку дифференциала ваз 2110 в тиски, круглогубцами снимаем стопорное кольцо с оси сателлитов.

Надавив на ось сателлитов, вынимаем ее из коробки.

Извлекаем из коробки сателлиты.

Для снятия подшипников дифференциала зажимаем коробку в тиски.

Вставив зубило в зазор между торцом внутреннего кольца подшипника и коробкой дифференциала, наносим удары по зубилу…

…и спрессовываем подшипник.

Коробка передач ВАЗ-2110: устройство, эксплуатация и ремонт

Каждый автомобилист знает, как выглядит ВАЗ-2110. Несмотря на то, что этот автомобиль прекратили выпускать более 5 лет назад, он по-прежнему пользуется спросом в небольших городах. Автомобиль во всех комплектациях оснащался механической коробкой передач. Мало кто знает ее устройство. Что ж, давайте рассмотрим устройство коробки передач ВАЗ-2110 и какие у нее «болезни».

Характеристика

Коробка передач - это блок, необходимый для передачи крутящего момента от двигателя на колеса транспортного средства.Двигатель внутреннего сгорания имеет узкий диапазон частоты вращения коленчатого вала, при котором максимальный крутящий момент достигает максимальных значений.

Проще говоря, в двигателе происходит «отключение». Таким образом, на одной передаче машина не может двигаться с разными скоростями. Ей либо не хватает тяги, либо она будет ехать очень медленно. Для этого в КПП ВАЗ-2110 имеет 5 скоростей. Благодаря разным передаточным числам вы можете достичь максимального крутящего момента на всех скоростях. Это позволяет автомобилю динамично двигаться при любых условиях работы двигателя.

Как это работает

Крутящий момент от маховика двигателя передается на вторичный, а затем на первичный вал. Благодаря коробке передач энергия крутящего момента передается на полуоси, а затем на колеса. Но он не может постоянно взаимодействовать с двигателем. Поэтому в конструкции предусмотрено сцепление. В «десятке» он самый распространенный - сухой, однодисковый. Нажимая на педаль, водитель выжимает диск сцепления. Далее рычаг переключения передач ВАЗ-2110 переводится в нужное положение.Педаль отпускается, машина едет на следующей передаче. Но поскольку у «дюжины» поперечное расположение мотора, для управления коробкой есть качелька.

У каждой скорости свое передаточное число. На механической коробке этот коэффициент явно завязан и не меняется при движении, как на вариаторе. Наибольшее передаточное число - на первой передаче. На ней машина самая тяговитая. Самый маленький (менее единицы) - на пятом. Машина проигрывает в скорости, но в то же время больше скорости.На первой передаче машина может разогнаться только до 30 километров в час, затем срабатывает «отсечка». Также КПП ВАЗ-2110 имеет заднюю передачу. Дополнительно механизм снабжен запирающими устройствами и замками. Эти элементы предохраняют трансмиссию от самопроизвольного отключения. Устройство блокировки не позволяет одновременно активировать две скорости.

Синхронизаторы

Наверняка опытные автовладельцы помнят, как на старых ЗИЛах и ГАЗонах переключались передачи - двойным отжимом с перегазовкой.На коробках этих грузовиков синхронизаторов не было.

Теперь им оснащается любой современный автомобиль. Чтобы исключить потерю времени и неудобства при «перегазовке», коробка передач ВАЗ-2110 оснащена синхронизаторами. Таким образом, во время вращения вала вы легко включите нужную передачу. Стоит отметить, что скорость вращения маховика и первичного вала при выжатом сцеплении различается. При выходе из строя синхронизаторов слышен характерный хруст при попытке включить правильную передачу.Все из-за - большой разницы в передаточном числе. Временно можно использовать «перегазовки», но не стоит ехать с неработающими синхронизаторами.

Это важный компонент любой коробки передач. Именно она уравнивает угловую скорость шестерен валов в процессе их вращения.

Проблемы в работе

Коробка - сложный механизм, и в нем иногда случаются сбои. Наиболее частыми на автомобиле ВАЗ-2110 являются:

  • Шумы при работе.Коробка характерно гудит. Это означает, что масло добывается внутри или его мало. Проверить щуп. Если шестерни долгое время работали «на всухую», коробку передач ВАЗ-2110 потребуется заменить. Чтобы избежать этой неприятности, регулярно проверяйте уровень масла в трансмиссии. Кстати, на КПП ВАЗ-2110 цена около 16 тысяч рублей.
  • Жесткое переключение передач. Эта неисправность связана со сцеплением или синхронизаторами. Проверить уровень жидкости в бачке. При выходе из строя главного или рабочего цилиндра сцепления привод работать не будет.Из-за проявки часто повреждается резиновый чехол. Оттуда течет вся жидкость. Если цилиндры сухие, проверьте выжимной подшипник. Если при нажатии на педаль сцепления шумит, значит, требуется ремонт коробки ВАЗ-2110. Для замены подшипника придется полностью снимать трансмиссию.
  • Люфт переключения передач. Поврежденный рычаг приклада мог быть поврежден. Также проверьте крепления на стыках.
  • Трансфер «Мухи». Если во время движения произошло самопроизвольное отключение, проверьте состояние колодок двигателя.Их три - при больших вибрациях мотор провоцирует выключение трансмиссии.
  • Скорости включаются с трудом, есть характерный звук. Если проблему решить с помощью «перегазовки», скорее всего, вышли из строя синхронизаторы.

Если есть потеки масла

Проверить состояние уплотнительных элементов - прокладок и уплотнений. Если из них потечет масло, замените элементы. Установлен новый на герметик (красный, силикон).

Правильная работа

Как расширить ресурс коробки? Все очень просто - придерживайтесь правил замены масла.

Да, здесь она не рабочая жидкость, как на гидротрансформаторе АКПП, а заполнена только наполовину. Но именно эта небольшая деталь обеспечивает смазку фрикционных шестерен. Производитель рекомендует менять масло каждые 90 тысяч километров. Многие автовладельцы уверены, что механические коробки не требуют обслуживания и жидкость в них залита на весь период. Но со временем в нем скапливается металлическая стружка - продукция из шестерен. Само масло очень темное.Как ни странно, но простая замена смазки увеличивает срок службы коробки в разы. При покупке обращайте внимание на вязкость. Специалисты рекомендуют использовать жидкость с параметром 75W90.

Стиль вождения

Не только масло влияет на ресурс трансмиссии. Не менее важная характеристика - манера вождения.

Часто автомобилисты не придерживаются пауз при переключении с первой на вторую передачу. Некоторые просто «рвут», причем с большой силой. Как следствие - износ синхронизаторов, нарастание валов и шестерен привода.Для обеспечения сохранности всех элементов трансмиссии включаются плавно. Особенно это касается разгона. При переключении на второй переведите селектор КПП в нейтральное положение на 0,5-1 секунду. Затем полностью включите вторую передачу. Вы сразу заметите эффект. После таких манипуляций передача включается очень легко. Коробке легче работать в этом режиме. Нагрузка на элементы трансмиссии будет минимальной.

Также не переключайтесь на двух передачах.Значит, вы много носите синхронизаторы. Если есть такая необходимость (например, при обгоне нужно набрать хороший крутящий момент), примените описанную выше «перегазовку». И просто поднятие оборотов двигателя, переключение на пониженную. Нагрузка на синхронизаторы будет минимальной, а трансмиссия не перенесет ударов.

Заключение

Итак, мы выяснили, как устроена и работает коробка передач ВАЗ-2110. Придерживаясь сроков замены масла и тихой езды, можно надолго затянуть ремонт коробки.Практика показывает, что в таких условиях трансмиссия «выздоравливает» более 300 тысяч (двигатель выйдет из строя быстрее, чем сама коробка).

Металлопротеаза SPRTN / DVC1 управляет репликационно-связанной репарацией перекрестных связей ДНК-белок

Резюме

Цитотоксичность перекрестных связей ДНК-белок (DPC) в значительной степени приписывается их способности блокировать развитие репликации ДНК. DPCs часто встречаются в клетках либо в результате метаболизма, либо в результате воздействия экзогенных агентов, но механизм репарации DPC до конца не изучен.Здесь мы характеризуем SPRTN как специализированную ДНК-зависимую и связанную с репликацией ДНК металлопротеиназу для репарации DPC. SPRTN расщепляет различные ДНК-связывающие субстраты во время S-фазы прогрессирования и, таким образом, защищает пролиферативные клетки от токсичности DPC. Клетки пациентов с синдромом Руйса-Альфа (RJALS) с моногенными и двуаллельными мутациями в SPRTN являются гиперчувствительными к агентам, индуцирующим DPC, из-за дефекта в развитии вилки репликации ДНК и неспособности устранить DPC. Мы предполагаем, что протеаза SPRTN представляет собой специализированный путь репарации DPC, связанный с репликацией ДНК, необходимый для прогрессирования репликации ДНК и стабильности генома.Дефектный SPRTN-зависимый клиренс DPC является молекулярным механизмом, лежащим в основе RJALS, а DPC вносят вклад в ускоренное старение и рак.

Ключевые слова: SPARTAN / DVC1, ДНК-зависимая металлопротеаза, репарация перекрестных связей ДНК-белок, репликация ДНК, синдром Руйса-Альфа / СПАРТАНЦА, рак, старение

Введение

Многочисленные эндогенные и экзогенные факторы постоянно атакуют геном, вызывая разнообразие химически различных повреждений ДНК (Lindahl, 1993).Если такие повреждения ДНК не восстанавливать, они приводят к нестабильности генома и гибели клеток (Jackson and Bartek, 2009). Клетки развили множество путей репарации ДНК, специализирующихся на различных типах повреждений ДНК (Friedberg et al., 2006, Lindahl and Wood, 1999). Сшивки ДНК-белок (ДПК) представляют собой пока еще недостаточно изученный тип повреждения ДНК, вызванный ковалентным присоединением белков к азотистым основаниям, сахару или разорванным фосфодиэфирным связям в основной цепи ДНК (Ashour et al., 2015, Tretyakova et al., 2015).Очень мало известно о том, как клетки удаляют DPC и восстанавливают вызванные DPC повреждения ДНК (Barker et al., 2005, Connelly and Leach, 2004, Stingele and Jentsch, 2015, Tretyakova et al., 2015). DPC индуцируются химическими реакциями, катализируемыми продуктами клеточного метаболизма, такими как альдегиды, или экзогенными источниками, включая УФ-свет и ионизирующее излучение (Ide et al., 2011, Shi et al., 2004). Практически любой белок в непосредственной близости от ДНК может образовывать неферментативный DPC в присутствии сшивающего соединения, такого как формальдегид (FA) (Shoulkamy et al., 2012). DPC также индуцируются ферментативно, когда определенные ДНК-связывающие ферменты образуют временные ковалентные взаимодействия с ДНК во время их физиологических реакционных циклов. Наиболее изученными ферментативными DPC являются топоизомеразы 1 и 2α (Topo1 и Topo2α), известные как комплексы расщепления Topo1- или Topo2α (Topo-ccs) (Ashour et al., 2015, Maede et al., 2014). Topo1-ccs или Topo2-ccs удаляются тирозил-ДНК фосфодиэстеразой-1 или -2 (TDP1 или TDP2) после протеолиза Topos на небольшие пептидные фрагменты (максимум 15–108 аминокислот) неизвестным механизмом (Debéthune et al., 2002, Интерталь, Шампу, 2011). Это указывает на существование протеазы, которая обрабатывает Topos выше TDP1 или 2 (Zhang et al., 2006). Несмотря на частое появление эндогенных неферментативных и ферментативных DPC в клетках, механизм удаления DPC все еще в значительной степени неизвестен (Ide et al., 2015).

Исследования на бактериях, дрожжах и высших эукариотах показывают, что несколько канонических путей репарации ДНК, включая эксцизионную репарацию нуклеотидов, гомологичную рекомбинацию и путь репарации анемии Фанкони вместе с протеасомозависимой деградацией белков, участвуют в удалении DPC (Barker et al. ., 2005, де Грааф и др., 2009, Накано и др., 2007, Салем и др., 2009). Недавно было показано, что дрожжевая ДНК-зависимая протеаза Wss1 (слабый супрессор smt3) защищает дрожжевые клетки от FA-индуцированной токсичности и, в координации с Tdp1, обрабатывает Topo1-ccs (Stingele et al., 2014).

В настоящее время нам неизвестны какие-либо специализированные пути репарации DPC у многоклеточных животных, хотя удаление DPC важно для прогрессирования репликационной вилки ДНК (Kuo et al., 2007, Reardon et al., 2006). Недавние биохимические данные экстракта яиц Xenopus продемонстрировали, что удаление DPC связано с репликацией ДНК протеасомно-независимым, но зависимым от протеаз образом образом (Duxin et al., 2014). Однако протеаза, необходимая для удаления DPC во время репликации ДНК, оставалась неизвестной (Duxin and Walter, 2015, Reardon et al., 2006).

Синдром Руйса-Алфса (RJALS), также известный как СПАРТАНСКИЙ синдром, представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание человека, характеризующееся хромосомной нестабильностью, преждевременным старением и ранним началом гепатоцеллюлярной карциномы у детей. RJALS вызывается моногенными и двуаллельными мутациями в SPRTN ( DVC1 ), а единственная миссенс-мутация в предполагаемом домене SprT металлопротеиназы (SPRTN Y117C ) является патогенным и ответственным за преждевременное старение и рак печени у людей (Lessel et al. al., 2014, Рамадан и др., 2016). В то время как роль C-концевых доменов SPRTN была широко охарактеризована в синтезе ДНК трансформации и привлечении к очагам повреждения ДНК, функция домена SprT, локализованного в N-концевой части, полностью неизвестна (Centore et al., 2012, Davis et al., 2012, Ghosal et al., 2012, Mosbech et al., 2012). На клеточном уровне клетки RJALS демонстрируют стресс репликации ДНК, в частности более медленную репликацию и повышенное количество остановившихся вилок и двухцепочечных разрывов ДНК (Lessel et al., 2014).

Учитывая важность SPRTN для стабильности генома и тот факт, что биоинформатический анализ предполагает, что SPRTN и дрожжевая протеаза Wss1 отдаленно связаны с семейством металлопротеаз Zinicin (Stingele et al., 2015), мы спросили, является ли SPRTN металлопротеиназа, отвечающая за восстановление ЦОД.

Здесь мы показываем, что SPRTN является ДНК-зависимой протеазой, которая защищает пролиферативные клетки человека от токсичности DPC. SPRTN связывается с механизмом репликации ДНК и удаляет DPC во время синтеза ДНК, и, таким образом, RJALS вызывается дефектом в репарации DPC.В целом мы определили механизм удаления DPC из хроматина в клетках человека и подчеркнули важность этого механизма для стабильности генома и его значимость для патогенеза человека при ускоренном старении и канцерогенезе.

Результаты

SPRTN предотвращает накопление эндогенных перекрестных связей ДНК-белок

Чтобы исследовать роль SPRTN в репарации DPC, мы выделили общую геномную ДНК из клеток HeLa и проанализировали количество DPC, используя быстрый подход к восстановлению аддуктов ДНК (RADAR) в сочетании с SDS-PAGE / окрашиванием серебром (A) (Kiianitsa and Maizels, 2013).Выделение ДНК в жестких денатурирующих условиях позволяет нам обнаруживать исключительно белки, сшитые с ДНК (DPC). Изоляты DPC количественно определяли по общему количеству ДНК, чтобы гарантировать равное количество ДНК для анализа DPC, а затем обрабатывали бензоназой для удаления всей ДНК и РНК перед детектированием с помощью SDS-PAGE / окрашивания серебром. Обработка протеиназой К DPC, обработанных бензоназой, подтверждает специфичность окрашивания белков методом окрашивания серебром (рис. S1A). Кроме того, обработка клеток известными агентами, индуцирующими DPC, FA, камптотецином (CPT) или этопозидом (ETO), как и ожидалось, вызывает огромное накопление общих (B) или специфических DPC (рисунок S1B).

SPRTN предотвращает накопление перекрестных связей между базальными ДНК и белками

(A) Схема протокола выделения DPC (RADAR).

(B) Накопление DPC в клетках HeLa после обработки FA (2,5 мМ, 30 мин).

(C) Дефицит SPRTN приводит к накоплению DPC (окрашивание серебром). Показаны профили количественной оценки и клеточного цикла (правые изображения).

(D) Количественное определение изолятов DPC методом осаждения SDS / KCl.

(E) Схема доменов белка SPRTN и предполагаемого активного сайта протеазы.

(F) Схема двуаллельных мутаций SPRTN у пациентов с RJALS.

(G) Общие уровни DPC после эктопической экспрессии SPRTN WT или E112A в Δ-SPRTN клетках HeLa и соответствующая количественная оценка. цельноклеточный экстракт: WCE.

(H) Общие уровни DPC в LCL пациентов с RJALS из семьи B (два пациента; B-II: 1 и B-II: 4) и контрольных LCL (CTR). Показаны профили количественной оценки и клеточного цикла (правое изображение). Среднее ± SEM, n = 3.

См. Также рисунок S1.

Количественный анализ общего количества DPC путем окрашивания серебром в различных клеточных линиях (HeLa, HEK293 и T24) показал, что истощение SPRTN приводит к 2-5-кратному увеличению общего количества белков, ковалентно связанных с ДНК (Рисунки S1C и S1D и данные не показаны).Сходным образом, CRISPR / Cas9-созданные SPRTN клетки HeLa с частичным нокаутом (Δ-SPRTN, Figures S1E – S1G) показали 3–4-кратное увеличение общего количества DPC (C). Накопление DPC, наблюдаемое в Δ-SPRTN клетках, было дополнительно подтверждено анализом преципитации SDS / KCl, косвенным методом выделения DPC (D). Увеличение количества DPC в SPRTN-дефицитных клетках не было связано с различиями в стадиях клеточного цикла (C, S1C и S1D). Чтобы исследовать, играет ли предполагаемый протеазный домен в SPRTN роль в удалении DPC, мы эктопически экспрессировали SPRTN дикого типа (SPRTN WT ) или E112A (SPRTN E112A ), вариант, содержащий замену глутаминовой кислоты на аланин в прогнозируемой активный центр протеазы (HEXXH, H; гистидин, E; глутаминовая кислота, X; и любая аминокислота; E) в Δ-SPRTN клетках HeLa.Сверхэкспрессия SPRTN WT , но не SPRTN E112A , полностью устраняет базальное накопление DPC (G, сравните дорожки 3 и 4). Чтобы выяснить, являются ли линии лимфобластоидных клеток (LCL) RJALS с моногенными и двуаллельными мутациями в SPRTN (F; SPRTN-ΔC / SPRTN Y117C ) также недостаточными для удаления DPC, мы выделили и проанализировали общее количество DPC в этих клетках (H ). Клетки RJALS показали увеличение общего количества DPC в 1,5–2 раза по сравнению с контрольными LCL (H, сравните дорожку 1 с дорожками 2 и 3).

Пути эксцизионной репарации нуклеотидов (NER) и гомологичной рекомбинации (HR) также участвуют в репарации DPC. Однако истощение основных компонентов NER (XPC) и HR (MRE11) малой интерферирующей (si) РНК не привело к увеличению общего количества DPC (рисунок S2A). Точно так же нарушение пути репарации межцепочечных сшивок ДНК, анемия Фанкони, из-за истощения FANCD2 не вызывало накопления DPC по сравнению с контрольными клетками (фигура S2A). В целом, эти результаты показывают, что SPRTN является основным игроком, участвующим в удалении DPC, и, более конкретно, что его предполагаемый активный остаток металлопротеазы (E112) важен для удаления эндогенно возникающих DPC в пролиферативных клетках человека.

RJALS и истощенные SPRTN клетки гиперчувствительны к агентам, индуцирующим DPC

Мы также спросили, являются ли LCL пациентов RJALS и истощенные siRNA SPRTN клетки HeLa гиперчувствительными к агентам, индуцирующим DPC. Мы использовали FA и метилглиоксаль, которые индуцируют общие DPC (B и данные не показаны), а также CPT и ETO, которые индуцируют специфические ферментативные DPC (рисунок S1B). И клетки пациента RJALS (A), и клетки с истощенным SPRTN (B и S2B) были гиперчувствительны к агентам, индуцирующим DPC. Чтобы проанализировать, как отдельные мутации SPRTN, обнаруженные у пациентов с RJALS, влияют на чувствительность клеток к DPC-индуцирующим агентам, мы создали индуцируемые доксициклином (DOX) и стабильные клеточные линии Flp-In HeLa, экспрессирующие ферментативный мертвый белок (E112A) дикого типа (WT), и варианты пациента SPRTN (C – 2H и S2C – S2F).Эктопическая экспрессия SPRTN WT , при которой эндогенный SPRTN был истощен siRNA, нацеленной на 3'-UTR транскриптов SPRTN, спасала гиперчувствительность SPRTN-истощенных клеток к FA (D) или CPT (рисунок S2C). И наоборот, сверхэкспрессия SPRTN E112A или варианта пациента SPRTN Y117C не способствовала снижению гиперчувствительности к FA (E и 2F, соответственно) или CPT (рисунки S2D и S2E, соответственно). Эктопическая экспрессия усеченного варианта пациента SPRTN-ΔC, который все еще содержит интактный предполагаемый домен металлопротеазы, частично устраняет гиперчувствительность к FA (G) или CPT (рисунок S2F).Обе мутации пациента обладают дефектной способностью защищать клетки от DPC, хотя SPRTN-ΔC в меньшей степени, поскольку LCL RJALS гиперчувствительны к агентам, индуцирующим DPC (A).

RJALS и SPRTN-истощенные клетки гиперчувствительны к DPC-индуцирующим агентам

(A) Анализы жизнеспособности клеток RJALS (B-II: 1 и B-II: 4) и контрольных (CTR) LCL после обработки указанными химическими веществами.

(B) Анализ клоногенной выживаемости контрольных siRNA (CTR) или клеток HeLa, истощенных siRNA SPRTN, после обработки указанными химическими веществами.

(C) Схема экспериментальной установки для анализа клоногенной выживаемости в клеточных линиях HeLa, индуцируемых доксициклином (+ Dox) SPRTN Flp-In.

(D – G) Эктопическая экспрессия SPRTN WT (D), SPRTN E112A (E), SPRTN Y117C (F) и SPRTN-ΔC (G) после истощения эндогенного SPRTN.

(H) Вестерн-блоттинг (WB) демонстрирует истощение и / или сверхэкспрессию SPRTN. Среднее ± SEM, n = 3.

См. Также рисунок S2.

Затем, чтобы выяснить, вызвана ли цитотоксичность, наблюдаемая в SPRTN-дефицитных клетках, накоплением DPC, мы совместно истощили Topo1 и SPRTN и контролировали выживаемость клеток после лечения CPT.Совместное истощение Topo1 полностью спасло чувствительность к CPT в SPRTN-истощенных клетках (рисунок S2G), подтверждая, что CPT-индуцированная токсичность в SPRTN-истощенных клетках обусловлена ​​накоплением Topo1-ccs. Совместное истощение TDP1, ключевого игрока в удалении Topo1-cc, не приводит к дальнейшей гиперчувствительности SPRTN-истощенных клеток к CPT, предполагая, что оба белка работают по одному и тому же пути (рис. S2H).

Известно, что путь анемии Фанкони защищает от токсичности, вызванной формальдегидом. Как и ожидалось, инактивация пути анемии Фанкони истощением миРНК FANCD2 вызывает гиперчувствительность клеток к лечению FA, но не к лечению CPT (рисунок S2I).Это также свидетельствует о том, что путь анемии Фанкони строго участвует в репарации перекрестных связей между нитями ДНК (также индуцированных обработкой FA), но не в перекрестных связях ДНК-белок (например, удаление специфического DPC, индуцированного CPT). В целом эти результаты предполагают, что SPRTN формирует уникальный путь репарации ДНК для удаления DPC.

SPRTN представляет собой ДНК-зависимую металлопротеазу

В результате интенсивной работы нескольких лабораторий не удалось определить активность протеазы SPRTN (Davis et al., 2012, Kim et al., 2013, Mosbech et al., 2012). Наши результаты заставили нас переоценить опубликованные данные и исследовать, действительно ли SPRTN является протеазой. С этой целью мы очистили SPRTN WT , SPRTN E112A , два варианта пациентов (SPRTN Y117C и SPRTN-ΔC) и несколько вариантов SPRTN, усеченных на С-конце, с использованием системы экспрессии белка E. coli .

Учитывая, что домен SprT классифицируется как предполагаемый домен металлопротеиназы, мы сначала проанализировали присутствие металла в белке SPRTN.Мы очистили SPRTN без C-концевого Zn-связывающего домена UBZ и PIP-бокса (SPRTN 1-268) и проанализировали его с помощью масс-спектрометрии. Анализ интактного белка SPRTN в нативных и денатурирующих условиях показал увеличение массы на 126 дальтон, что соответствует присутствию двух ионов цинка (рисунок S3A). Недавнее открытие, что дрожжевой протеазе Wss1 необходима ДНК для проявления протеолитической активности (Balakirev et al., 2015, Stingele et al., 2014), привело нас к исследованию, связывает ли SPRTN ДНК. Мы использовали двухцепочечные ДНК-зонды (dsDNA) длиной 63 п.н., меченные флуоресцеинизотиоцианатом (FITC), для анализа аффинности связывания SPRTN по поляризации флуоресценции.Белок SPRTN WT показал высокое сродство к дцДНК (константа диссоциации [K D ] ≈100 нМ) (A). Анализ in silico вторичной структуры SPRTN выявил наличие пяти участков связывания ДНК: четырех мотивов в С-концевой части белка и одного в протеазном домене SprT (B и S3B). Удаление предсказанных C-концевых участков связывания ДНК сильно снижает аффинность связывания ДНК SPRTN (A).

SPRTN представляет собой ДНК-зависимую металлопротеиназу с аутопротеолитическими свойствами

(A) Анализ связывания ДНК флуоресценции с поляризацией SPRTN и его усеченных на С-конце вариантов.

(B) Схема предсказанных in silico областей связывания ДНК (зеленые квадраты) в белке SPRTN и в вариантах SPRTN, усеченных на С-конце.

(C) Аффинность связывания ДНК SPRTN WT , SPRTN E112A и SPRTN Y117C по отношению к ds, ss и расширенной ДНК.

(D) ДНК индуцирует аутопротеолиз SPRTN. Мутация E112A или 1,10 фенантролин (фен) подавляет активность SPRTN. Расщепление анализировали на гелях SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием кумасси синим.

(E) WB, иллюстрирующий авторасщепление SPRTN.

(F) WB общих клеточных лизатов после эктопической экспрессии FLAG-SPRTN (WT или E112A) после обработки FA. Антифосфо (P) Chk2 представляет собой положительный контроль для активации передачи сигналов повреждения ДНК.

(G и H) Ферментативные реакции in vitro, как в (D), с указанными мутациями пациента.

(I) Количественная оценка активности авторасщепления. Среднее ± стандартное отклонение, n = 3.

См. Также рисунок S3.

Затем мы спросили, связывает ли SPRTN разные структуры ДНК.SPRTN WT связывает одноцепочечную ДНК (оцДНК), дцДНК и расщепленную ДНК с аналогичным сродством (C). SPRTN E112A и SPRTN Y117C показали сходное сродство к ДНК, что и SPRTN WT . Укороченный вариант SPRTN-ΔC (1-246) показал пониженное сродство к ДНК (K D ≈ 0,48 мкМ; A), что коррелирует с потерей предполагаемых сайтов связывания ДНК (B и S3B).

Мы наблюдали повышенные уровни деградации SPRTN WT , когда реакцию SPRTN и ДНК инкубировали в течение более длительного периода времени и анализировали с помощью SDS-PAGE / окрашивания кумасси синим.Полноразмерный белок SPRTN WT был в основном интактным и имел прогнозируемый размер 55 кДа (D, дорожка 1). Однако инкубация SPRTN WT с дцДНК вызвала сильную деградацию SPRTN с несколькими видимыми полосами белка и заметным накоплением фрагмента ~ 25 кДа (D, дорожка 2). Масс-спектрометрический анализ продуктов деградации SPRTN WT выявил по меньшей мере пять различных продуктов расщепления в белке SPRTN (фигура S7C) с сайтами расщепления, расположенными в его C-концевой части (фигура S3C).Активность авторасщепления SPRTN WT ингибировалась в присутствии 1,10 фенантролина, известного ингибитора Zn 2+ -зависимых металлопротеиназ (D, дорожка 3). Активность авторасщепления SPRTN была отменена мутацией E112A (D, дорожка 5). Вестерн-блот-анализ продуктов авторасщепления SPRTN WT с антителами, индуцированными против N- или C-концевых фрагментов SPRTN, дополнительно подтвердил данные масс-спектрометрии и продемонстрировал, что белок SPRTN в основном расщеплялся в его C-концевой части, в то время как N-концевой фрагмент остался в основном неповрежденным (E, дорожки 2 и 5).Эти данные позволяют предположить, что SPRTN является ДНК и Zn-зависимой протеазой, которая обладает активностью авторасщепления in vitro. SPRTN WT , но не SPRTN E112A , продукты авторасщепления также были видны в клетках HEK293, особенно после обработки FA, демонстрируя активность авторасщепления SPRTN in vivo (F).

Мы также спросили, какова минимальная длина ДНК, необходимая для активации активности расщепления SPRTN (рисунок S3D). Зонды оц- или дцДНК разного размера инкубировали с белком SPRTN WT .Фрагменты ДНК 100-мерной оцДНК или дцДНК были наиболее эффективными активаторами активности авторасщепления SPRTN.

Чтобы исследовать, являются ли мутации пациентов RJALS дефектными в отношении их активности авторасщепления, мы протестировали два варианта пациентов, SPRTN Y117C и SPRTN-ΔC (G – 3I). SPRTN-ΔC показал активность авторасщепления, аналогичную SPRTN WT , тогда как SPRTN Y117C показал снижение активности авторасщепления на ~ 80% по сравнению с SPRTN WT (I).Учитывая, что SPRTN Y117C связывает ДНК со сродством, аналогичным SPRTN WT , мы заключаем, что его ферментативный дефицит не связан с нарушением связывания ДНК. Наши результаты показывают, что SPRTN Y117C напрямую влияет на активный центр протеазы (E112), который расположен всего в пяти аминокислотах выше мутации. SPRTN-ΔC (1–246) все еще сохраняет активность авторасщепления, аналогичную SPRTN WT (H и 3I), несмотря на его более низкое сродство к ДНК (A).

Активность транс-расщепления SPRTN-металлопротеиназы

Чтобы выяснить, происходит ли авто-расщепление SPRTN в цис или в транс , мы инкубировали SPRTN WT с ферментативно-мертвым вариантом SPRTN (SPRTN E112A ).SPRTN WT расщепил SPRTN E112A (Рисунок S3E, сравните дорожки 2 и 4). Эти данные предполагают, что SPRTN расщепляет себя на транс . Чтобы проверить важность связывания ДНК для активности транс-расщепления, мы инкубировали два усеченных на С-конце варианта SPRTN, которые имеют среднее (SPRTN 1-268 ) или низкое (SPRTN 1-218 ) сродство к ДНК с SPRTN . E112A (A для сродства к ДНК). SPRTN 1-268 расщепил SPRTN E112A с эффективностью, аналогичной SPRTN WT (Рисунок S3E, сравните дорожку 4 с дорожкой 6).Напротив, SPRTN 1-218 заметно потерял активность транс-расщепления (рисунок S3E, сравните дорожку 4 с дорожкой 8). Затем мы спросили, является ли ДНК каркасом или аллостерическим активатором активности авторасщепления SPRTN. Активность авторасщепления SPRTN WT была максимальной при эквимолярных концентрациях белка и ДНК в реакции. Увеличение концентрации ДНК постепенно подавляло активность SPRTN (рисунок S3F). В целом эти результаты показывают, что ДНК служит каркасом, который сближает SPRTN и его субстрат, а не действует как аллостерический активатор.Потеря его C-концевых участков связывания ДНК делает SPRTN неспособным выполнять свою протеолитическую активность, предполагая, что саморасщепление снижает протеолитическую активность расщепленных форм.

Идентификация субстратов SPRTN

Мы выделили DPC из контрольных и истощенных по SPRTN клеток HeLa (рис. S4A) и проанализировали их количественной масс-спектрометрией без меток. Три независимых эксперимента выявили 84 значительно увеличенных (в 1,5 раза) белков в DPC в SPRTN-истощенных клетках по сравнению с контрольными клетками (рисунок S4B и репозиторий исходных данных: PRIDE).Хотя многие из идентифицированных субстратов были ДНК- и РНК-связывающими белками, большинство из них были белками, не связывающими ДНК (рисунок S4C). Учитывая, что любой белок в непосредственной близости от ДНК может быть сшит, особенно белки ядерного матрикса, это неудивительно. Соответственно, белки, не связывающие ДНК, такие как Lamin B1 и DNA-PK, обогащены DPC, выделенными из Δ-SPRTN клеток (G).

Удаление DPC во время S-фазы клеточного цикла

(A) Схема экспериментального подхода, используемого для синхронизации клеток T24 в G0 и мониторинга уровней DPC во время входа в S-фазу.

(B) Общие уровни DPC в G0-, поздней G1- и S-фазе до и после истощения SPRTN в клетках HeLa, визуализированные окрашиванием серебром. WB циклина A и профили клеточного цикла использовали в качестве контроля входа в S-фазу.

(C) WB, демонстрирующий экспрессию или истощение SPRTN в нерепликативных и репликативных клетках T24.

(D) Схема измерения жизнеспособности репликативных и нерепликативных клеток.

(E) Жизнеспособность репликативных и нерепликативных клеток T24 после истощения SPRTN и обработки FA.

(F) Общие уровни DPC после высвобождения G1 / S в клетках HeLa WT и Δ-SPRTN, визуализированные окрашиванием серебром. WB циклинов и профили клеточного цикла (нижние изображения) использовали для контроля прогрессирования S-фазы.

(G) WB, показывающий присутствие ДНК-PK и ламина B1 в DPC в Δ-SPRTN клетках HeLa после высвобождения G1 / S. Экстракт цельных клеток: WCE. Среднее ± SEM, n = 3.

Мы сосредоточились на гистонах и ДНК-топоизомеразах, ДНК-связывающих белках с хорошо охарактеризованными клеточными функциями, которые оказались среди лучших хитов (≥1.98-кратное увеличение) в нашем масс-спектрометрическом анализе (рис. S4D). Чтобы подтвердить данные масс-спектрометрии, мы проанализировали конкретные DPC, выделенные, как показано на A, методом иммунодетекции слот-блоттингом. Истощение SPRTN двумя разными миРНК значительно увеличивало количество Topo1, Topo2α, гистона h4 и гистона h5 (A и 4B). Чтобы продемонстрировать, что гипераккумуляция Topo1 была специфичной для потери активности протеазы SPRTN, мы эктопически экспрессировали SPRTN WT или SPRTN E112A в 3'-нацеленных на UTR siRNA-истощенных SPRTN клетках.Эктопическая экспрессия SPRTN WT , но не SPRTN E112A , спасла накопление Topo1 (Topo1-cc) (рисунок S4E). Мы дополнительно проанализировали Topo1-ccs после лечения CPT (C). И SPRTN-истощенные клетки, и LCL пациентов накапливают больше Topo1-ccs по сравнению с контрольными клетками, что дополнительно подтверждает фундаментальную важность активности протеазы SPRTN в удалении Topo1-ccs и защите от цитотоксичности DPC (Рисунки S2B – S2H).

Идентификация субстратов SPRTN

(A) Слот-блоты, показывающие присутствие DPC Topo1, Topo2α, h4 и h5 после истощения SPRTN в клетках HeLa и соответствующие количественные оценки.Среднее ± SEM, n = 3.

(B) контроли загрузки ДНК для анализа DPC, до обработки бензоназой, как в (A).

(C) Слот-блоты, показывающие накопление Topo1-ccs после непрерывной обработки CPT, как указано, в Δ-SPRTN клетках (левое изображение) и LCL RJALS (правое изображение).

(D) WB и соответствующая количественная оценка, показывающая, что SPRTN расщепляет гистон h4 в присутствии ДНК. Среднее ± стандартное отклонение, n = 3.

(E) Временная кинетика расщепления h4 по сравнению с саморасщеплением SPRTN в одних и тех же реакционных смесях, выраженная как увеличение расщепления h4 или SPRTN с течением времени (мин).Среднее ± SD, n = 3.

(F) Сравнение времени, реакции расщепления h4 для SPRTN WT и SPRTN-ΔC, как в (D). Ось y была нормализована по шкале от 0% до 100%. Среднее ± SD, n = 3.

(G) Гистон h4, Topo1 и Topo2α являются субстратами протеазы SPRTN. Продукты расщепления ( * ) были обнаружены WB с использованием антител против гистона h4 (верхнее изображение), Topo2α (среднее изображение) или Topo1 (нижнее изображение). FL, полная длина.

(H) Множественное выравнивание последовательностей продуктов расщепления гистонов (CP), показывающее сайты расщепления (стрелка) в их неструктурированных N-концевых хвостах ( * обозначает альтернативные продукты расщепления).

См. Также рисунки S4 и S5.

Характеристика ферментативной активности SPRTN

Чтобы охарактеризовать способность SPRTN расщеплять идентифицированные субстраты, мы выполнили анализы активности расщепления in vitro с использованием очищенного белка SPRTN WT . SPRTN WT расщеплял все тестируемые гистоны, h3A, h3B, h4 и h5, ДНК-зависимым образом, но не цитозольный белок глутатион-S-трансферазу (D, S5A и S5B). Кинетический анализ авторасщепления SPRTN и расщепления гистона h4 в одной и той же реакции показал, что SPRTN расщепляет h4 с немного более быстрой кинетикой, чем он сам (E).Это говорит о том, что SPRTN одновременно расщепляет субстраты и себя, но с более высоким предпочтением субстрату. Это, скорее всего, приводит к инактивации SPRTN, поскольку расщепленные продукты SPRTN теряют аффинность связывания ДНК (A), ферментативную активность (рисунок S3E) и имеют в 2 раза более низкую кинетику процессивности субстрата (F). Это может быть одним из механизмов, помимо регуляции клеточного цикла (см. Ниже), с помощью которого протеаза SPRTN саморегулируется для предотвращения вредоносного и неконтролируемого расщепления в непосредственной близости от нее.

Затем мы протестировали активность расщепления различных вариантов SPRTN, уделяя особое внимание гистону h4 (D и 4G). Как и ожидалось, каталитически неактивный SPRTN E112A не расщеплял гистон h4. Подобно активности авторасщепления SPRTN, вариант пациента SPRTN Y117C сильно пострадал в отношении расщепления гистона h4 (~ 8% активности), тогда как SPRTN-ΔC сохранил активность, аналогичную SPRTN WT . Мы распространили анализ активности расщепления на два других идентифицированных субстрата, Topo1 и Topo2α.С этой целью мы очистили YFP-Topo1 и GFP-Topo2α из экстрактов целых клеток в денатурирующих условиях и инкубировали их с различными вариантами SPRTN. SPRTN WT , но не SPRTN E112A , расщеплял Topo1 и Topo2α in vitro, тем самым подтверждая, что Topo1 и Topo2α являются субстратами SPRTN (G, дорожки 2 и 3). Характеристика мутаций пациентов показала, что SPRTN Y117C не может расщеплять Topo1 и Topo2α. Неожиданно, в отличие от авторасщепления (H) и расщепления гистона h4 (D и 4G), SPRTN-ΔC показал сильно сниженный протеолиз Topo1 и Topo2α in vitro, аналогично наименьшей авторасщепляемой форме SPRTN (1–227). ) (G, дорожки 5 и 6).Эти данные показывают, что протеаза SPRTN расщепляет различные ДНК-связывающие субстраты ДНК-зависимым образом. Активности протеазы SPRTN серьезно препятствует мутация Y117C пациента для всех тестируемых субстратов. Укороченный пациентом вариант SPRTN-ΔC, хотя и способен расщеплять сам себя и гистон h4, проявляет сильно сниженную активность по отношению к Topo1 и Topo2α, предполагая, что С-концевая часть SPRTN необходима для оптимального протеолиза этих субстратов.

SPRTN - плейотропная протеаза для ДНК-связывающих белков

Затем мы стремились идентифицировать сайты расщепления протеазой SPRTN и спросили, расщепляется ли протеаза SPRTN по конкретному мотиву аминокислотной последовательности.Продукты расщепления h3A, h3B, h4 и h5, а также продукты авто-расщепления SPRTN анализировали с помощью масс-спектрометрии для идентификации сайтов расщепления (H и S5C). Мы обнаружили, что SPRTN расщепляет гистоны h3A, h3B, h4 и h5 в пределах их неструктурированного, положительно заряженного N-концевого хвоста. Все идентифицированные области расщепления были обогащены остатками аргинина и лизина и в большинстве случаев находились в очень непосредственной близости от остатков серина. Анализ сайтов авторасщепления SPRTN (CS) также показал обилие остатков лизина, аргинина и серина (CS 1 и 3), в то время как, в частности, CS3 сильно обогащен серинами (и, в меньшей степени, лизинами и аргининами) ( Рисунок S3C).Подобно сайтам расщепления гистонов, которые присутствуют в неупорядоченных областях белка (N-конец), SPRTN расщепляет себя во многих местах на своем С-конце, который преимущественно неупорядочен (рисунок S5D). Эти результаты предполагают, что SPRTN не является протеазой, специфичной для последовательности, а расщепляет неструктурированные белковые области вблизи остатков лизина, аргинина и серина.

Чтобы проверить, расщепляет ли SPRTN также DPC in vitro, мы выделили общие DPC с помощью анализа преципитации SDS / KCl и инкубировали их с рекомбинантным SPRTN.SPRTN WT , но не SPRTN E112A , расщепляет DPC in vitro (рисунок S6A). На данный момент наши результаты in vitro и in vivo предполагают, что SPRTN расщепляет ДНК-связывающие белки независимо от их статуса связывания с ДНК (т.е. ковалентные DPC или нековалентные). Чтобы дополнительно проверить это наблюдение, мы выделили связанный с хроматином Topo1 или Topo2 в денатурирующих условиях как из необработанных клеток HEK293, так и из клеток, обработанных CPT или ETO, соответственно. Эффективность расщепления SPRTN очищенных иммуноочисткой Topo1 и Topo2α была сходной для необработанных и обогащенных Topo1 / 2α-cc образцов (обработанных CPT и ETO, соответственно; Фигуры S6B и S6C).В целом, эти данные предполагают, что SPRTN не специфически расщепляет DPC, а специфически расщепляет ДНК-связывающие субстраты, и что SPRTN действительно является плейотропной протеазой, поскольку он расщепляет большинство высокомолекулярных DPC in vitro (рисунок S6A, сравните дорожки 1 и 2). .

SPRTN удаляет DPC во время S-фазы и защищает пролиферативные клетки от DPC-индуцирующих агентов

Учитывая, что экспрессия SPRTN отсутствует в G1-фазе клеточного цикла и быстро активируется, когда клетки входят в S-фазу (Mosbech et al. al., 2012), мы предположили, что SPRTN участвует в удалении DPC во время синтеза ДНК. Чтобы проверить эту гипотезу, мы проанализировали уровни DPC во время S-фазы прогрессирования в контрольных и истощенных SPRTN клетках. Мы использовали клетки T24, которые останавливаются в фазе G0 за счет контактного ингибирования при 100% конфлюэнтности и синхронно входят в S-фазу при разведении до более низких плотностей. Клетки задерживали в G0, обрабатывали контрольной миРНК или SPRTN-миРНК в течение 2 дней, а затем разбавляли для перехода в S-фазу (A). Мы контролировали общее количество эндогенных DPC во время прогрессирования S-фазы.DPC быстро удаляли по мере прохождения контрольных клеток через S-фазу. Напротив, клетки с истощенным SPRTN показали замедленную кинетику удаления DPC во время S-фазы прогрессирования (B, сравните дорожки 2 и 3 с 5 и 6). Вестерн-блот-анализ клеток T24 показал, что SPRTN не экспрессируется в клетках G0 (C), что дополнительно указывает на важную роль SPRTN в защите от DPC во время синтеза ДНК. Чтобы исследовать эту гипотезу, мы обрабатывали G0-арестованные или пролиферативные клетки T24 контрольной или siRNA SPRTN в течение 2 дней, подвергали клетки воздействию сублетальной дозы FA в течение дополнительных 2 дней, а затем контролировали жизнеспособность клеток (D).Действительно, только пролиферативные клетки с истощенным SPRTN, но не G0-арестованные клетки, были гиперчувствительными к FA (E). Кроме того, Δ-SPRTN клетки HeLa в огромной степени накапливают общие DPC во время прогрессирования S-фазы по сравнению с контрольными клетками (F). Эти данные показывают, что SPRTN обрабатывает DPC во время S-фазы прогрессирования, таким образом защищая клетки от цитотоксичности DPC.

SPRTN является составной частью механизма репликации ДНК

Продемонстрировав, что SPRTN защищает пролиферативные клетки человека от DPC, и зная, что мутация пациента SPRTN Y117C важна для невозмущенного прогрессирования вилки репликации ДНК (Lessel et al., 2014), мы спросили, является ли SPRTN частью механизма репликации ДНК. Мы изолировали SPRTN-SSH из общих экстрактов клеток HEK293 над стрептактин-сефарозой в условиях высокого содержания соли и детергента, чтобы удалить все неспецифические связывающие белки из SPRTN-комплексов in vivo. SPRTN соосаждался с основными компонентами аппарата репликации ДНК: PCNA, субъединицами 2 и 6 комплекса поддержания минихромосом (MCM) и ДНК-полимеразой δ (A). Затем мы спросили, присутствует ли SPRTN физически на сайтах вилок репликации ДНК.Чтобы ответить на этот вопрос, мы выделили белки из зарождающейся ДНК с помощью технологии iPOND. Подобно PCNA, MCM3 и ДНК-полимеразе δ, SPRTN присутствовал на формирующейся ДНК (B, дорожка 2) и перемещался вместе с реплисомой, как показано тимидиновой погоней (B, дорожка 3). В целом эти данные предполагают, что SPRTN является частью механизма репликации ДНК и перемещается вместе с реплисомой во время синтеза ДНК.

SPRTN является частью механизма репликации ДНК и регулирует прогрессию вилки репликации ДНК

(A) CoIP SPRTN-Strep-Strep-His (SSH) из клеток Flp-In HEK293, стабильно экспрессирующих SPRTN при индукции Dox, демонстрируя связь с реплисомой белки.

(B) Схема подхода iPOND (верхнее изображение). iPOND демонстрирует, что SPRTN движется вместе с реплисомой. Клетки HEK293 обрабатывали EdU в течение 10 мин для мечения растущей ДНК (дорожка 2), а затем гнали тимидином, где указано (зрелая ДНК, дорожка 3).

(C) iPOND, демонстрирующий повышенное удерживание белков реплисом на зрелой ДНК в Δ-SPRTN клетках HeLa (дорожки 6 и 7).

(D) Анализ волокон ДНК в клетках HeLa после сверхэкспрессии FLAG-SPRTN WT или пустого FLAG-вектора.Показаны типичные волокна ДНК (верхнее изображение). Показана количественная оценка длины IdU-меченного тракта в присутствии агентов, индуцирующих DPC (50 мкМ FA, 25 нМ CPT). Цифры (зеленые) - это средние значения длины тракта в килобазах.

(E) Анализ ДНК-волокон в LCL RJALS (B-II: 1) и контрольных LCL после обработки FA или CPT, выполняемой как в (D).

(F) Количественное определение фокусов 53BP1 в положительных по циклину А клетках HeLa WT или Δ-SPRTN после обработки FA (50 мкМ). Данные представляют кратное изменение в фокусах 53BP1 по сравнению с необработанными клетками (момент времени 0) (верхнее изображение).Показаны репрезентативные микрофотографии фокусов 53BP1 в положительных по циклину клетках через 6 часов после обработки FA (нижнее изображение). Среднее ± SEM, n = 3.

См. Также рисунок S6.

SPRTN управляет прогрессией вилки репликации ДНК путем удаления DPC

Мы также спросили, влияет ли инактивация SPRTN на развитие механизма репликации ДНК. Мы изолировали вилки репликации ДНК с помощью iPOND и наблюдали за их развитием в контрольных и Δ-SPRTN клетках HeLa (C). Нокаут SPRTN серьезно повлиял на прогрессию репликации ДНК, как показано удержанием PCNA и MCM3 на зрелой ДНК (тимидиновая погоня, C, сравните дорожки 3 и 4 с дорожками 6 и 7).Дефекты в развитии вилки репликации ДНК в клетках Δ-SPRTN были продемонстрированы с помощью анализа волокон ДНК (рис. S6D). Замедленные вилки репликации ДНК в Δ-SPRTN-клетках накапливали Topo1 (рис. S6E), один из субстратов протеазы SPRTN in vitro и in vivo. Эти результаты показывают, что SPRTN регулирует прогрессию реплисом и предотвращает накопление Topo1 в сайтах вилок репликации ДНК. Мы также спросили, взаимодействует ли SPRTN физически с Topos. С этой целью мы совместно осаждали SPRTN, как описано ранее, и анализировали присутствие Topo1 и Topo2α в комплексе SPRTN.Эксперименты по совместной иммунопреципитации показали, что SPRTN действительно образует комплекс как с Topo1, так и с Topo2α in vivo (рисунок S6F).

Чтобы исследовать, как DPC влияют на репликацию ДНК, мы использовали анализ волокон ДНК (D). Обработка контрольных клеток низкой дозой FA или CPT вызвала сильное снижение синтеза ДНК, обнаруживаемое как снижение скорости вилки репликации ДНК, когда второй нуклеотид (IdU) инкубировали вместе с FA или CPT. Эктопическая экспрессия SPRTN WT спасала DPC-индуцированный дефект прогрессии репликационной вилки ДНК как в контрольных, так и в Δ-SPRTN клетках (D и S6D).Измеряя скорость вилки репликации ДНК в LCL RJALS, мы обнаружили, что клетки RJALS показали более сильное снижение (~ 2,5 раза) прогрессии вилки репликации ДНК, чем контрольные клетки при заражении FA или CPT (E). В целом, эти результаты предполагают, что SPRTN важен для прогрессирования вилок репликации ДНК, зараженных DPC-индуцирующими агентами, и является ограничивающим фактором в этом процессе, поскольку снижение скорости вилки в контрольных клетках, обработанных FA / CPT, или клетках Δ-SPRTN может быть восстановлено с помощью SPRTN WT сверхэкспрессия.

SPRTN предотвращает DPC-индуцированные DSB в S-фазе

Мы предположили, что снижение скорости вилок репликации ДНК в SPRTN-истощенных клетках или клетках RJALS в присутствии агентов, индуцирующих DPC, приводит к длительному задержанию реплисом и, как следствие, к ДНК. коллапс репликационной вилки, визуализируемый как ds-разрывы ДНК (DSBs), фенотип, наблюдаемый у пациентов с RJALS (Lessel et al., 2014). Мы непрерывно подвергали контрольные или Δ-SPRTN клетки воздействию мягких доз FA или CPT и контролировали образование фокусов 53BP1, признанного маркера DSB, в течение 6 часов с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии в фиксированных клетках.Окрашивание циклином А использовали в качестве маркера для клеток, положительных по S- / G2-фазе. Образование фокусов 53BP1 индуцировалось как в позитивных, так и в негативных клетках по циклину А после обработки FA или CPT, что дополнительно подтверждает генотоксичность, индуцированную DPC (F и S6G – S6I). Однако среднее количество фокусов 53BP1 на клетку увеличивалось в 2–3 раза после обработки FA или CPT в положительных по циклину A Δ-SPRTN клетках HeLa по сравнению с контрольными клетками HeLa (F и S6G). Напротив, количество фокусов 53BP1 в циклин A-отрицательных клетках было одинаковым как в Δ-SPRTN, так и в контрольных клетках (Фигуры S6H и S6I).Эти результаты предполагают, что SPRTN предотвращает DPC-индуцированные DSB во время синтеза ДНК.

Обсуждение

Мы раскрыли механизмы понимания активности протеазы SPRTN для репарации DPC и установили SPRTN как протеазу, связанную с репликацией ДНК (). Наша работа определяет отсутствующую протеазу, участвующую в репликации ДНК и процессинге сшивок топоизомеразы 1 и 2 (Ashour et al., 2015, Duxin et al., 2014, Gao et al., 2014, Interthal and Champoux, 2011). Биохимическая характеристика мутаций SPRTN у пациентов с RJALS показывает, что RJALS вызывается дефектом активности протеазы SPRTN, что делает его неспособным обрабатывать DPC во время репликации ДНК и, следовательно, приводит к стрессу репликации ДНК, одной из основных причин нестабильности генома и рака.

Модель восстановления DPC, связанного с репликацией ДНК

SPRTN является составной частью реплисомы и расщепляет DPC во время развития репликационной вилки. Протеаза SPRTN защищает пролиферативные клетки от цитотоксичности, вызванной DPC (слева). Дефицит SPRTN (мутации SPRTN у RJALS, гаплонедостаточные SPRTN мыши) вызывает остановку вилки репликации ДНК из-за патологического накопления DPC, что, в свою очередь, приводит к DSB и геномной нестабильности (справа).

Протеолиз SPRTN, связанный с репликацией ДНК

Наши результаты согласуются с недавними биохимическими данными в экстракте яиц Xenopus , показывающими, что протеолиз, связанный с репликацией ДНК, необходим для удаления DPC (Duxin et al., 2014), модель, предложенная лабораторией Санкара (Reardon et al., 2006). Однако фермент этого пути оставался неизвестным до сих пор, когда мы показали, что SPRTN является активной протеазой и составной частью реплисомы. Принимая во внимание, что DPC распространены повсеместно и что практически любой белок, присутствующий в непосредственной близости от ДНК, может быть сшит, протеолитическая активность SPRTN в репликации ДНК имеет важное значение. Динамика клеточного цикла экспрессии SPRTN подтверждает нашу гипотезу, при этом SPRTN отсутствует в G0 T24-клеток и появляется при входе в S-фазу.Это согласуется с опубликованными данными, показывающими, что уровень SPRTN подавляется в клетках в фазе G1 с помощью E3-ubiquitin ligase APC-комплекса и усиливается, когда клетки входят в S-фазу (Mosbech et al., 2012). Поэтому мы предполагаем, что это путь репарации ДНК для удаления DPC в пролиферативных клетках. Мы не можем исключить потенциальную роль SPRTN в непролиферативных клетках, но если она существует, эта функция не связана с репарацией DPC, связанной с репликацией ДНК.

Восстановление перекрестных связей ДНК-белок

Наша работа направлена ​​на решение нового вопроса в области репарации ДНК: как DPC удаляются из хроматина? Несмотря на частое появление DPC, мы плохо понимаем процесс восстановления DPC (Ide et al., 2015). Считается, что репарация DPC частично зависит от двух канонических путей репарации ДНК, NER и HR (Barker et al., 2005, Nakano et al., 2007). Однако оба пути репарации ограничены тем фактом, что NER может действовать только на более мелкие сшивки белков, не превышающие 11 кДа, а HR полагается на образование DSB, которое приводит к рекомбиногенным событиям и связанной с ними геномной нестабильности. Как следствие, другие механизмы репарации должны быть вовлечены в процессинг DPC и поддержание стабильности генома.Действительно, накопление DPC не наблюдается ни при инактивации ключевых игроков NER и HR, ни при пути анемии Фанкони (рис. S2A), что позволяет предположить, что SPRTN-зависимый путь репарации DPC является основным специализированным путем репарации DPC в клетках человека. Ранняя эмбриональная летальность мышей с нокаутом SPRTN (Maskey et al., 2014) и идентификация SPRTN как одного из основных генов в геноме человека (Hart et al., 2015, Wang et al., 2015) еще раз подтверждают вывод о том, что SPRTN является критическим компонентом уникальной системы репарации ДНК, а именно пути репарации DPC.

Характеристика мутаций пациента RJALS

Мы продемонстрировали, что протеазная активность мутации пациента SPRTN Y117C сильно влияет на все тестируемые субстраты. Причина, по которой мутация Y117C влияет на ферментативную активность SPRTN, не ясна. Сравнение последовательностей показывает, что этот остаток не является строго консервативным среди гомологов SPRTN (фигура S7A), хотя он обычно является гидрофобным даже среди более широкого семейства цинцина. Непосредственная близость Y117 к каталитическому центру, расположенному всего на два остатка ниже второго потенциального Zn-связывающего гистидина (h215), и неконсервативный характер замены указывают на то, что вариант может быть неспособен образовывать активный сайт с правильная геометрия.Возможно, это результат стерических эффектов, включающих расположение конца HEXXH-содержащей спирали и последующей петли, содержащей третий потенциальный лиганд Zn 2+ .

Другая патогенная мутация, SPRTN-ΔC, протеолитически активна по отношению к себе (авторасщепление) и гистонам (H и D), но серьезно нарушена в процессинге Topo1 и Topo2α (G). Чувствительность истощенных SPRTN клеток к CPT не может быть полностью восстановлена ​​с помощью SPRTN-ΔC, предполагая, что эта мутация пациента, хотя и протеолитически активна, не может должным образом обрабатывать определенные субстраты, такие как Topo1 и Topo2.Одна из причин может заключаться в том, что С-концевая часть важна для связывания определенных субстратов и участвует в специфичности субстрата SPRTN. Повышенные уровни DPC в клетках пациентов с RJALS и неспособность репликации ДНК в клетках RJALS справиться с индукцией неферментативных (FA) или ферментативных (CPT) DPC, демонстрируют, что DPC, такие как Topo1 и Topo2α, и наиболее вероятно многие другие являются основной причиной синдрома RJALS. Мы предполагаем, что RJALS - это заболевание человека, связанное с дефектным путем репарации DPC.

Сравнение SPRTN и Wss1

Биоинформатический анализ предполагает, что SPRTN и Wss1 имеют общего предка (Stingele et al., 2015). Хотя верно то, что оба фермента отдаленно родственны суперсемейству металлопротеиназы цинка, две последовательности можно выровнять только по относительно короткой области остатков из 95 аминокислот (аа) с 24% идентичностью последовательностей (сравнивая последовательность S. cerevisiae человека и S. cerevisiae ). ферменты) (Рисунок S7B). Эта общая область включает консервативный мотив HEXXH, общий для более широкого набора ферментов с различными функциями, который обеспечивает платформу для связывания Zn 2+ через два гистидина, причем соседний остаток глутамата, как полагают, играет роль в катализе (Hooper, 1994).Кроме этого общего ядра, не удалось найти никаких других областей сходства последовательностей. Wss1 и SPRTN проявляют сходные ферментативные свойства, но их клеточная функция частично не связана. SPRTN взаимодействует с аппаратом репликации ДНК и связывает убиквитинированные субстраты посредством своих Ub-связывающих доменов, тогда как Wss1 связывает и обрабатывает SUMOylated субстраты посредством своих взаимодействующих с SUMO мотивов (Balakirev et al., 2015). Инактивация SPRTN вызывает массовое накопление общих DPC в пролиферативных клетках человека, включая Topo1, Topo2α и гистоны.Напротив, дрожжевые клетки, лишенные Wss1, не накапливают общие DPCs и не обнаруживают гиперчувствительности к CPT (Stingele et al., 2014).

2110 - коробка передач. Ремонт КПП ВАЗ-2110

Для переключения скоростей используйте ответственный агрегат, например коробку передач. Этот механизм довольно сложен и при неправильном использовании может быстро выйти из строя. Посмотрим, как делается ремонт на ВАЗ-2110. Коробка передач здесь хоть и надежная, но за ней нужно ухаживать, вовремя менять масло, чистить от грязи т. Д.Пункт

Общие положения

Если что-то случилось, то в первую очередь необходимо демонтировать или, проще говоря, снять КПП. Работу желательно проводить с помощником. Сначала снимаем аккумулятор с автомобиля, а затем стартер. Трос сцепления также необходимо отсоединить от вилки и вытащить непосредственно из кронштейна на коробке передач. На датчике скорости очень много проводов, которые нужно отсоединить. Для этого сжимаем пружинные фиксаторы и демонтируем башмак.Редуктор крепится к реактивной тяге несколькими болтами, с помощью ключа соответствующего размера их необходимо открутить. Следующим шагом будет снятие приводов колес, оставив там заглушку. Левую шаровую опору тоже нужно отвернуть от кулака. В принципе так сделать нельзя, но так намного удобнее. Со стороны двигателя есть одно крепление, откручиваем гайку, при необходимости снимаем инжекторный шланг со шпильки. Сейчас на ВАЗ-2110 завершающий этап разборки сборки, коробку передач нужно сдвинуть с направляющих как можно дальше назад.


Как разобрать КПП: несколько простых советов

Перед тем, как приступить к непосредственной разборке, очистите механизм. Для этого можно использовать бензин или что-то в этом роде. Сначала снимаем щуп, показывающий уровень масла, а затем откручиваем все крепления троса сцепления. Осталось только разобрать заднюю крышку, у нее 4 болта, которые надо открутить. Чаще всего плоской отверткой приходится цепляться за крышку. Дальше вы увидите вилку последней, то есть 5-й скорости (трансмиссии), снимите с нее крепление.Необходимо закрепить валы от проворачивания, для этого шлицы муфты должны войти в зацепление с шестерней. Чтобы это произошло, поставьте 5-ю передачу. Далее нет ничего сложного. Снимите первичные валы и устраните неисправности. Если дело в деформации или критическом износе, то деталь явно требует замены.

Ремонт коробки передач ВАЗ-2110

Чаще всего из строя выходит либо первичный, либо вторичный вал, а также синхронизатор или дифференциал. В принципе возможности мастера здесь ограничены, например, конструкция первичного вала не разборная.Единственное, что можно сделать, это поменять подшипники. Для этого снимите подшипник съемником и вдавите его таким же образом до упора. Учтите, что усилие можно приложить только к внутреннему кольцу. Замена переднего подшипника такая же. Обратите внимание только на наличие стопорного кольца при установке детали. Вторичный вал разборный, поэтому отремонтировать можно практически любую вышедшую из строя деталь. Сначала снимаем его с корпуса и зажимаем вал в тисках, чтобы можно было рукой регулировать угол его наклона, но не повредить.Здесь можно увидеть множество шестерен - ведущую и ведомую. Осмотрев визуально, вы сможете выявить дефекты (стирание зубов, потертости и т. Д.). Далее удалите поврежденную деталь, ее можно либо доработать, либо поставить новую.

ВАЗ-2110: коробка передач и ее ремонт

Посмотрим на синхронизатор. Чаще всего проблема заключается в износе муфты, ее повреждениях и подобных проблемах. Чтобы не забыть, как именно муфта располагалась в ступице, нанесите соответствующую разметку мелом.Шарики установлены на пружине, поэтому следите за тем, чтобы шарики не разлетались при работе с синхронизатором. Далее у вас есть два пути решения проблемы - это замена устройства целиком или установка новых отдельных частей, вышедших из строя. Как показывает многолетняя практика, на ВАЗ-2110 выходит из строя коробка передач из-за повреждения бисквита (сколы, задиров) или дефектов пазов сцепления (износ, другие дефекты). В любом случае ремонтировать вышедшую из строя деталь не рекомендуется, лучше сразу установить новую.Это связано с тем, что такая запчасть долго не проработает. Перед тем, как полностью собрать синхронизатор, смажьте пружину и бисквит. Для этого можно использовать «Литол» или что-то в этом роде. Обратите внимание на надежность установки хомутов (пружин).

Как отремонтировать дифференциал?

Конечно, данный редуктор в сборе можно считать слабым звеном. Сначала проверьте целостность подшипников. Обратите внимание, что если вы планируете их удалить, они рухнут, поэтому вам нужно будет установить новый комплект.Опять же придется менять все кольца, полуоси, а также сальники коробки передач ВАЗ-2110. Визуально можно оценить состояние шестерни спидометра. Подшипник можно снять, не повредив его, но шестерня сломается, но если она отслужила, то ничего страшного. Прежде чем все собрать, нужно внимательно осмотреть ведомую шестерню. Наличие задиров, износ на зубах говорит о том, что его нужно менять. Предварительная обработка или наплавка в этом случае допускается только в профессиональном исполнении.Следует отметить, что ведомая шестерня продается в сборе с ведущей, поэтому всегда производите замену пары. Причина в том, что передаточное число может немного отличаться.

Заключение

Если вы хотите, чтобы ваша коробка передач работала как часы, вы должны соблюдать несколько простых условий. Самое главное - вовремя менять прокладки. Как только вы заметили, что смазка потекла, нужно заменить сальники. Не забывайте, что коробку передач ВАЗ-2110 тоже нужно периодически менять.Как правило, это один раз на 40 000-50000 километров. Еще один важный момент - своевременный ремонт, ведь если вы услышите непонятный стук или звон в коробке, это может обернуться полной заменой. Как известно, это большие расходы. Дело в том, что коробка передач ВАЗ-2110, цена которой составляет около 10 000 рублей, продается далеко не везде, и не всегда оригинальная. Пожалуй, это все, что можно сказать о ремонте КПП. При правильном подходе у вас не возникнет никаких трудностей, в том числе потому, что большинство деталей просто заменяется, а не ремонтируется.

№ 8 Бобры не спотыкаются с QB Коди Ваз

Через несколько мгновений после того, как Коди Ваз впервые выступил в качестве стартового квотербека в штате Орегон, Интернет загудел.

`` ВАЗзле-Даззл '', `` ВАЗ-такулар '' и `` ВАЗ-матазз '' были среди прозвищ, о которых шла речь. В Твиттере была популярна песня Cody Vaz.

Ваз, сделавший свой первый старт со школы, бросил на 332 ярда и трижды приземлился в победе штата Орегон № 8 над BYU в субботу со счетом 42–24.Он выполнил 20 из 32 передач.

Юниор ростом 6 футов 1 см, заменивший травмированного квотербека Шона Мэнниона, был назван игроком недели Pac-12 в понедельник.

: `` Не думаю, что кто-то в нашей раздевалке был особенно удивлен хорошей игрой Коди, - сказал тренер Майк Райли. `` Думаю, они давно верят в него как в товарища по команде ''.

В дополнение к классному завершению на 59 ярдов Брандину Куку и еще одному стабильному 29-ярдовому игроку в тайт-энд Коннору Гамлетту, Ваз заблокировал защитника BYU, который проложил путь Маркусу Уитону, чтобы забить на 12-ярдовой четвертой. - реверс четверти, увеличивший преимущество штата Орегон до 11 очков.

Ваз был профессионалом на протяжении всей игры и даже подбадривал команду перед началом четвертой четверти.

`` Я просто сказал: `` Четвертый квартал - наш квартал '' ... Я просто хотел немного поднять настроение '', - сказал Ваз.

Теперь говорят о футболках от бренда Beavers BelieVAZ.

Перед началом субботы Ваз сыграл за «Бобров» всего пять матчей, выполнив шесть из 17 передач на 48 ярдов. Он не играл в живом матче с 2010 года.

Победа над BYU переместила «Бобров» к открытию сезона 5: 0, их лучший старт с 1939 года. Выступление Ваза стало последним сюрпризом в неожиданном сезоне для штата Орегон, который в прошлом году проиграл всего 3-9.

Травма Мэнниона также стала неожиданностью даже для Райли. Второкурсник ростом 6 футов 5 дюймов был травмирован при передаче в результате победы «Бобров» со счетом 19-6 над штатом Вашингтон неделей ранее, но он так и не покинул игру и закончил с передачей на 270 ярдов и приземлением.

Два дня спустя Бобры узнали, что Мэнниону понадобится операция по восстановлению мениска в левом колене. На прошлой неделе ему сделали операцию, и он выбыл на неопределенный срок, хотя может вернуться до конца регулярного чемпионата.

Маннион в среднем показывал 339,5 ярдов, проходя игру, затем занимал второе место в Pac-12 и шестое место в стране. В этом сезоне он совершил бросок на 1358 ярдов с семью тачдаунами и четырьмя перехватами. Он занимает шестое место в списке карьеры штата Орегон с 4686 ярдами.

В прошлом сезоне, будучи первокурсником в красной рубашке, Мэннион обошел младшего стартера Райана Каца, который начал сезон 2010 года за Бобров.С тех пор Кац перебрался в штат Сан-Диего, сделав Ваз резервным в этом сезоне.

Ваз вырос в Лоди, штат Калифорния, и играл в старшей школе Святой Марии, где за два сезона ему было 24-5 в стартовом составе. Он был игроком года по версии Stockton Record в старшем сезоне.

Но он играл второстепенную роль до прошлой субботы. Бобры, которые показывают счет 3: 0 в игре Pac-12, принимают "Юту" в субботу вечером на стадионе "Резер".

: `` Это просто отличный признак того, что парень будет готов долгое время, и это часть идентичности нашей футбольной команды '', - сказала Райли.`` Ребята готовятся к игре, и когда их вызывают, они входят и делают свою работу ''.

Дэрил Ваз - Информационная служба Ямайки

Hon. Дэрил Ваз был министром без портфеля в Министерстве экономического роста и создания рабочих мест и отвечал за портфели земель, окружающей среды, изменения климата и инвестиций.

24 июня 2020 года он принял на себя ответственность за портфели водоснабжения и жилищного строительства и вопросы, связанные с некоторыми специальными проектами экономического развития.

Министр Ваз служил на Ямайке на нескольких должностях. Он бывший министр без портфеля в канцелярии премьер-министра, отвечающий за информацию и телекоммуникации. Он также занимал пост государственного министра в канцелярии премьер-министра, отвечая за реализацию проектов и предоставление услуг.

Он был официальным представителем оппозиции по вопросам земли и окружающей среды, а также ИКТ и развития цифрового общества.

Министр Ваз - действующий член парламента Западного Портленда, место, которое он занимает с 2007 года.Среди его достижений в Западном Портленде - завершение строительства многофункционального комплекса Fruitful Vale. Этот межучрежденческий проект был реализован в сотрудничестве с Фондом социальных инвестиций Ямайки, CHASE и Фондом развития спорта, его стоимость составила около 26 миллионов ямайских долларов. Этот проект включал ремонт общественного центра, создание игровой площадки и многоцелевого корта с твердым покрытием.

Через Фонд Digicel министр Ваз также создал общественное предприятие под названием Fruitful Vale Life Improvement Project, которое в настоящее время обеспечивает занятость на неполный рабочий день для множества людей в округе, обеспечивая при этом мясо птицы по доступной цене для образовательных учреждений и малых местных предприятий.

В ходе своей политической карьеры министр Ваз занимал должность заместителя казначея Лейбористской партии Ямайки, эту должность он занимал с 2006 по 2010 год.

Проницательный бизнесмен, министр Ваз был президентом-основателем Ямайской ассоциации продавцов подержанных автомобилей.

Он учился в подготовительном колледже Моны, колледже Кэмпион и муниципальном колледже Майами Дейд в Майами, Флорида.

Он женат на Анн-Мари Терезе Ваз, у них пятеро детей.

Ремонт автомобиля ВАЗ 2105.Заказ ВАЗ. Ремонт и обслуживание «Жигулей. Коробка передач

».

ВАЗ 2104,2105 с двигателями 1.5, 1.5i, устройство 1.6i, обслуживание, диагностика, ремонт (PDF, 57MB)
Настоящая книга по ремонту ваз классического семейства с полноцветной иллюстрацией. Процесс разборки и ремонта снабжен подробными фотографиями и комментариями. Книга предназначена для автолюбителей, своими силами обслуживающими «Жигули».


ВАЗ-2104,2105 и модификации Руководство по ремонту (PDF, 31МБ)
Руководство по обслуживанию и ремонту автомобилей «Жигули» четвертой и пятой моделей.Рассматривается ремонт на базе готовых запчастей, есть возможные неисправности и способы их устранения.
В руководстве описаны следующие автомобили:
- Седан ВАЗ-2105 с двигателем 1,3 л.
- Седан ВАЗ-21051 с двигателем 1,1 л.
- Седан ВАЗ-21053 с двигателем 1,5 л.
- Фрамесажир «Универсал» на ВАЗ- 2104 на базе 2105
- универсал ВАЗ-21043 с двигателем 1,5 л


Автомобили «Жигули» ВАЗ-2104, -2105, -2107 Устройство и ремонт (DJVU, 7МБ)
Описание «Жигулей» четвертой, пятой и седьмой модели в объеме, достаточном для качественного ремонта.Возможные неисправности, пределы износа и допуски. Издание 3-е, первое издание вышло в 1989 г. Авторы В.А. Верчигора, А.П. Игнатов, К.В. Новокшонов, К.Б. Пятков, ред. Транспорт, 1996.


Руководство по ремонту и обслуживанию автомобилей семейства ВАЗ-2104, 2105 (DJVU, 48MB)
Еще одна книга ВАЗ по ремонту. Предназначен для специалистов СТО и индивидуальных владельцев.


Руководство по ремонту и каталог деталей ВАЗ 2104, 2105. Официальное издание ОАО «АвтоВАЗ», Москва 2001 (DJVU, 14MB)
Наиболее полное пособие по ремонту автомобилей ВАЗ 2104, ВАЗ-2105 и их модификаций по материалам производителя АвтоВАЗ на вопросы устройства, обслуживания и ремонта.Может быть, послужит плюсом при подготовке специалистов на сотню. Это книга ВАЗа.

Альбомы на классические автомобили ВАЗ


Большой альбом ВАЗ-2103, ВАЗ-2106 и их модификации (PDF, 13MB)
Иллюстрированное многоразовое пособие знакомит читателя с общей компоновкой и устройствами основных узлов и механизмов автомобилей ВАЗ-2103 и ВАЗ-2106. и их модификации ВАЗ-21033, ВАЗ-21035, ВАЗ-21061, ВАЗ-21063, ВАЗ-21065. Художники Э. Брейкин, В.Ф.ЕРМОЛИН, Н.П.Омаков, В. Скребников.

Одним из самых популярных автомобилей, выпускаемых заводом ВАЗ, является пятерка Жигулей , а именно ВАЗ 2105 «Жигули». С конвейера этот автомобиль вернулся в 1980 году. По формату «Вазовская пятерка» - заднеприводный четырехдверный седан, рассчитанный на пятерых пассажиров. Позже в основе этой модели появились не менее известные модели:

. - ВАЗ-2107. ;
- ВАЗ-2104 универсал.

Внешний вид автомобиля полностью соответствовал своему времени, а именно восьмидесятому.Кузов пятерки состоял из прямых линий, бампер из алюминия, объемные фары прямоугольной формы. Далее описывать внешние данные всем известной пятерки, смысла нет. Даже спустя более 30 лет этот автомобиль остается узнаваемым и популярным.

Изначально ВАЗ-2107 комплектовался карбюраторным двигателем объемом 1,3. Но были и комплектации двигателей с масляными фильтрами по типу 2101. Двигатели на этой модели постоянно модернизировались, делая их более мощными и бесконечными.

Технические характеристики ВАЗ-2105: Двигатель объемом 1,3 и мощностью 64 л.с. Размеры кузова снаружи следующие: длина - 4130 мм, ширина - 1620 мм, высота - 1446 мм. Дорожный просвет адаптирован к нашему бездорожью и составляет 17 сантиметров. Но багажник имеет не большой объем, всего 385 литров. Расход топлива в смешанном цикле - около 10 литров на 100км.

Модель ВАЗ-2105 полюбилась еще и за то, что она не совсем хороша в эксплуатации. Это позволяет сделать несложный ремонт и тюнинг своими руками.

Несмотря на частые ремонты и несоответствие стандартам современного автомобилестроения, ВАЗ-2105 остается одной из самых популярных моделей. Невысокая стартовая стоимость, простота ремонта и обслуживания делают эту модель правдой в народе.

Машины советского производства просты в эксплуатации и обслуживании. Ремонт ВАЗ 2105 можно провести в гараже. Речь идет не о капитальном ремонте, а о наладке и устранении неисправностей.

ВАЗ 2105 - советская модель малого класса.Впервые фиделайн появился в 1980 году. Последний автомобиль модели 2105 сошел с конвейера в сентябре 2012 года.

ВАЗ 2105 создан на базе итальянского автомобиля Fiat 124 1966 года выпуска.

Второе название ВАЗ 2105 - "Жигулевская пятерка". После распада СССР модель была переименована в LADA 2105.

. ВАЗ 2105

был представлен в большом количестве модификаций. Производители изготовили версию модели для служб безопасности и для участия в митинге.

Технические характеристики

ВАЗ 2105 - доработанная модель ВАЗ 2101. Кузов и подвесные детали позаимствованы у прародителя 2105. Остальные узлы прошли доработку.

Салон

Элементы салона выполнены из некачественного пластика. Автовладельцы жалуются на появление сверчков. Внутри салона мало - троим на заднем сиденье будет тесно. За 30 лет производители не внесли существенных изменений во внутреннее устройство автомобиля.

Низкая шумоизоляция. В машине гудит работающий мотор.

Двигатель

Производители предлагали две версии двигателей:

  • 1,5-литровый силовой агрегат мощностью 72 л. из.;
  • 1,3-литровый силовой агрегат 64 л. из.

1,3-литровым двигателем комплектовали экспортные автомобили ВАЗ 2105. Для внутреннего рынка производители выпускали модель всего с 1,5-литровым силовым агрегатом.

Двигатель унаследовал блок цилиндров от ВАЗ-2101.Производители отказались от использования цепи и оснастили распредвал с приводом от двигателя. Модификация снизила шумность силового агрегата. Но полностью проблему не устранил.

Подвеска

Дизайн ВАЗ-2105 копия всей ВАЗской «классики». Передняя подвеска - двойная, задняя - неразрезной мост. За 30 лет выпуска глобальных апгрейдов основы конструкции не заложили.

ВАЗ-2105 сохранил недостатки «классики».

Коробка передач

Изначально модель выпускалась с 4-ступенчатой ​​механикой. Более поздние модели стали набирать 5-ступенчатую MCPP - положительно сказалось на расходе топлива.

Тюнинг


Любители отечественного автопрома тюнингуют ВАЗ 2105. Дорабатываем заводские неисправности и меняем внешний вид с помощью воздушных змеев, покраски авто, подсветки.

Технический тюнинг можно сделать и без сотки. Заменен поршень и сцепление, подбор передаточного числа в коробке.Увеличивают жесткость подвески и могут быть заменены амортизационные пружины и рычаги.

После изменения технических показателей ВАЗ-2105 необходимо доработать тормозную систему автомобиля - обновить тормозные колодки, задние суппорты.

Книга из серии самостоятельных полноцветных иллюстрированных руководств по ремонту автомобилей. В инструкции показаны особенности конструкции узлов и систем автомобилей ВАЗ-2104, -2105. Подробно описаны основные неисправности, их причины и способы устранения.Процессы разборки и ремонта иллюстрированы и снабжены комментариями. Отдельный раздел посвящен особенностям ремонта автомобилей с двигателями, оснащенными системой впрыска топлива. В приложениях представлены инструменты, смазочные материалы и эксплуатационные жидкости, неровные уплотнения, подшипники, моменты затяжки резьбовых соединений, а также электрооборудование. Книга рассчитана на водителей, желающих отремонтировать машину своими силами, а также на сотню рабочих.

На нашем сайте вы можете скачать книгу «ВАЗ-2104, -2105 с моторами 1.5; 1.5i; 1.6i. Устройство, обслуживание, диагностика, ремонт: «Иллюстрированное руководство» бесплатно и без регистрации в формате FB2, RTF, EPUB, PDF, TXT, прочтите книгу онлайн или купите книгу в интернет-магазине.

ДНК-протеиновые перекрестные протеазы в стабильности генома

Wss1 и SPRTN: обнаружены первые представители класса репаративных ферментов

Репарация протеолиза DPC была обнаружена в дрожжах с помощью металлопротеиназы Wss1 3 . Сопутствующее исследование яичного экстракта Xenopus намекало на аналогичный путь у многоклеточных животных 33 .Выделенным ферментом у многоклеточных животных позже оказался SPRTN 4,5,6 . Однако филогенетический анализ показал, что Wss1 и SPRTN являются не ортологами, а функциональными гомологами 1,11,34 . Сходство между их последовательностями ограничено в пределах протеазных доменов - WLM и SprT - и вокруг активного центра, типичного для металлопротеаз (HExxH), и они демонстрируют 24% идентичность 5 (рис. 2).

Wss1 и SPRTN придают устойчивость к FA, показывая общую роль в ремонте DPC. 3,4,5,6 .Это также подтверждается исследованиями расщепления in vitro, которые демонстрируют, что Wss1 и SPRTN могут обрабатывать ДНК-связывающие белки различного размера и структуры, примером которых является меньший гистон h4 и более крупный Topo-2 3,4,5,6 . Хотя Wss1 способен обрабатывать очищенный Topo-1, только делеция WSS1 не сенсибилизирует дрожжевые клетки к CPT, что резко контрастирует с эффектами истощения SPRTN в клетках млекопитающих 3,5 . Это связано с существованием дрожжевой протеазы с аналогичной функцией и будет обсуждаться ниже.Хорошее объяснение этой неразборчивости было получено из структурных исследований дрожжевого домена WLM 35 . Поскольку домен протеазы не имеет кармана для связывания субстрата, он может вмещать широкий спектр структур. В результате протеолиза DPC остаточный пептид еще неустановленного размера прикреплен к ДНК. Хотя этот остаток менее проблематичен для репликации и транскрипции ДНК, его необходимо восстанавливать с помощью других активностей (например, нуклеаз, тирозил-ДНК-фосфодиэстераз) в координации с протеолизом или после него.Как это достигается, не совсем понятно.

Активные протеазы DPC потенциально опасны, и клетки применяют стратегии для ограничения их активности 7 . Во-первых, Wss1 и SPRTN связываются и активируются одноцепочечной (ss) и двухцепочечной (ds) ДНК 3,4,5,6,36,37,38 ; эта функция защищает растворимые в ядрах белки от нежелательного протеолиза. Структура домена SprT из человеческого SPRTN предполагает, что зависимость от ДНК зависит от экранирования активного сайта в отсутствие ДНК; Связывание ДНК открывает узкую бороздку с каталитическими остатками для расщепления пептида 37 .Во-вторых, Wss1 и SPRTN способны к саморасщеплению trans в присутствии ДНК; это свойство является регуляторным механизмом для отключения протеазной активности на хроматине 4 . В-третьих, активность протеаз DPC дополнительно обостряется посттрансляционными модификациями (фосфорилирование, убиквитилирование, SUMOylation, ацетилирование) протеаз DPC и / или их субстратов, а также взаимодействием с белками-партнерами, например, скользящим зажимом PCNA (пролиферирующим клеточным ядром). антиген), АТФаза p97 или связывающий белок Topo-1 TEX264.Последний пункт будет раскрыт в отдельный абзац.

Новые протеазы DPC в стабильности генома

В последнее время в качестве потенциальных ферментов репарации DPC появились протеазы, отличные от SPRTN. Это ACRC / GCNA, FAM111A и B, DDI1 и DDI2 у человека и их соответствующие ортологи. Среди ферментов человека SPRTN является единственным важным геном в различных линиях раковых клеток (Таблица 1; www.depmap.org).

Таблица 1 Важность генов, кодирующих протеазы DPC.

Эти появляющиеся протеазы DPC были связаны с процессингом DPC и прочно связанными белками (рис. 2 и 3). Помимо протеазного домена, на котором картируются консервативные каталитические остатки (Fig. 2), они обладают замечательным сходством в общей организации домена, которая лежит в основе потенциально сходных паттернов регуляции. Тем не менее, некоторые протеазы могут быть более специфичными для определенной фазы клеточного цикла, стадии развития или класса субстратов.

Рис. 3: Перекрывающиеся и неперекрывающиеся функции протеаз DPC.

a Wss1 и Ddi1 оба необходимы для репарации неферментативных DPC и Topo-1cc во время репликации. b FAM111A и SPRTN оба участвовали в разрешении Topo-1cc на основании сопротивления CPT. c Чувствительность к ингибиторам PARP-1 и анализы расчесывания ДНК позволяют предположить, что FAM111A, но не SPRTN, участвует в разрешении захваченного PARP-1. d GCNA человека разрешает перекрестные связи DNMT1 в сайтах включения 5-azadC (красная стрелка) за вилкой репликации. e GCNA разрешает Topo-2cc у мух, червей и рыбок данио.

ядерный антиген зародышевой клетки; также известный как белок, содержащий кислотные повторы (ACRC)]

Ядерный антиген зародышевой клетки (GCNA) содержит домен металлопротеазы SprT, законсервированный у эукарий 11,39 . У многоклеточных животных он экспрессируется в половых клетках, где недавно было показано, что он нацелен на Topo-2ccs 40,41 . GCNA, эктопически экспрессируемая в клетках культуры млекопитающих, также участвует в разрешении индуцированных 5-azadC сшивок DNMT1 42 (рис.3). GCNA не важен в клеточных линиях млекопитающих (таблица 1), но его нокаут (KO) увеличивает шансы эмбриональной летальности у мух, червей и рыбок данио 40 .

Белки, индуцируемые повреждением ДНК 1 (DDI1) и DDI2

Белки DDI1 и DDI2 представляют собой аспарагиновые протеазы, которые взаимодействуют с убиквитином и протеасомой через убиквитин-подобный домен (UBL) 43,44 (рис. 2). Они способствуют перезапуску протеасомно-зависимой репликационной вилки после репликативного стресса посредством деградации фактора терминации репликации 2 (RTF2) 44 .Непосредственное участие в репарации DPC еще не изучено, однако недавно было показано, что гомолог S.cerevisiae Ddi1 помогает Wss1 в разрешении CPT-индуцированных и FA-индуцированных DPCs 45,46 .

Семейство со сходством последовательностей 111 член A (FAM111A)

FAM111A и его гомолог FAM111B являются сериновыми протеазами. О FAM111B известно немного, за исключением его связи с этиологией формы пойкилодермии с легочным фиброзом (ПОИКТМП) 47 .FAM111A был ранее описан как взаимодействующий с PCNA и его роль в ограничении репликации вируса в клетках-хозяевах 48,49,50 . Только недавно он был вовлечен в репарацию Topo-1cc и захватил PARP-1 51 (Figs. 3 and 4).

Рис. 4: Протеолиз не-DPC субстратов во время репликации ДНК.

a Wss1 расщепляет избыточные гистоны, связывающиеся с оцДНК после остановки вилки. оцДНК образуется после HU. b PARP-1 рекрутируется в ДНК для восстановления различных типов повреждений, включая аддукты оснований, генерируемые алкилирующими агентами.В присутствии ингибиторов PARP блокируется само-PARylation и диссоциация хроматина. Захваченный PARP-1 представляет собой барьер для репликации. FAM111A придает устойчивость к ингибиторам PARP, но вопрос о том, протеолитически ли он действует на PARP-1, требует формальной проверки. c Во время репликации ДНК SPRTN расщепляет C-конец Chk1 и высвобождает активный домен киназы (K) из хроматина.

Доказательства того, что GCNA, DDI и FAM111A расщепляют субстраты DPC, в настоящее время отсутствуют. Однако они обладают каталитической активностью.Саморасщепление FAM111A было показано in vitro и в клетках 51,52 ; Sc Ddi1 и Hs DDI2 обрабатывают субстраты, модифицированные длинными убиквитиновыми цепями in vitro 53,54 . Более того, исследования комплементации показывают, что мутации в предполагаемых каталитических остатках GCNA 40 , Sc Ddi1 45 и FAM111A 51,52 генерируют нефункциональные белки. Для Sc Ddi1 активность in vitro была протестирована в присутствии дцДНК, активатора Wss1 и SPRTN, но безуспешно. 45 .Хотя ДНК-зависимая активность была установлена ​​как регуляторный механизм для Wss1 и SPRTN, разные протеазы могут отвечать на разные способы регуляции.

Общей чертой протеаз DPC является связывание с ДНК, что является подтверждением их функции, связанной с хроматином. Минимальные ДНК-связывающие домены (DBD, рис. 2) были картированы путем тестирования усеченных версий в обоих анализах связывания ДНК (например, EMSA) - как для Wss1, SPRTN и FAM111A 3,4,5,37,51,55 - или исследования комплементации в клетках - как для HDD Ddi1 (спиральный домен Ddi1) 45,46 .Подобно SPRTN и Wss1, FAM111A может связывать оцДНК, и целостность этого домена необходима для саморасщепления in vitro, а также для его функции в клетках 51 . Возможная интерпретация оцДНК-зависимого протеолиза будет разработана позже.

Перекрывающиеся функции протеаз DPC

Существование различных протеаз DPC указывает на то, что клетки инвестировали в несколько ферментов для противодействия DPC-зависимой токсичности (рис. 3). Это не удивительно, учитывая гетерогенную природу сшитых белков.Хотя SPRTN не обладает строгой специфичностью последовательности, он предпочтительно расщепляет ДНК-связывающие белки в плохо структурированных областях, богатых остатками лизина, аргинина и серина 5 . Существование альтернативных протеаз могло бы гарантировать, что сшитые белки, лишенные этих свойств, эффективно процессируются для предотвращения геномной нестабильности. Здесь мы подчеркиваем функциональное перекрытие между Wss1, SPRTN и другими протеазами.

У многоклеточных животных GCNA преимущественно экспрессируется в половых клетках и ранних эмбрионах 39 .Поэтому большинство исследований проводилось на животных моделях, а не на клетках человека. В Drosophila и C.elegans , мутация GCNA подвергает зародышевые клетки и эмбрионы стрессу репликации - образованию очагов RPA / γh3Ax и чувствительности к гидроксимочевине (HU) - и геномной нестабильности, например, дефектам сегрегации хромосом и микроядер, которые общий предел репродуктивного успеха 40,41 . C.elegans дефекты фертильности усугубляются сопутствующими мутациями в гомологе SPRTN dvc-1 40,41 .Эмбрионы Drosophila , мутировавшие как в Gcna , так и в mh (материнский гаплоид, mh, является гомологом Drosophila SPRTN), не завершают эмбриогенез 40 . Устанавливая роль в репарации DPC вместе с DVC-1 / mh, делеция GCNA увеличивает общее количество DPC в половых клетках и ранних эмбрионах мух, червей и рыбок данио 40 , причем Topo-2cc является одним из самых распространенных 40,41 . Dvc-1 и gcna-1 эмбрионы мутантных червей одинаково чувствительны к формальдегиду 42 .В целом это указывает на перекрытие между GCNA и DVC-1 на уровне организма. Зародышевые клетки и эмбрионы особенно уязвимы для геномной нестабильности, возникающей в результате накопления DPC, поскольку ошибки могут передаваться по наследству. Кроме того, изменения в экспрессии генов и деметилирование гистонов во время эмбиогенеза 56 могут особенно подвергать зародышевые клетки высвобождению FA 17 и образованию DPC, что объясняет необходимость наличия множественных протеаз DPC.

S.cerevisiae Ddi1 и человеческий FAM111A необходимы для устойчивости к Topo-1ccs, общей мишени дрожжевого Wss1 и человеческого SPRTN.В отличие от одной мутации wss1 , делеция WSS1 и DDI1 сенсибилизирует дрожжевые клетки к CPT и идентифицирует Ddi1 как неуловимую, избыточную протеазу для репарации Topo-1cc 3,45 . Генетические данные дополнительно указывают на то, что Ddi1 придает устойчивость к DPC-индуцирующему агенту FA вместе с Wss1 45,46 .

SPRTN и FAM111A также имеют перекрывающиеся функции. Оба белка были обнаружены в зарождающейся ДНК 5,50,57 , и оба предотвращают остановку репликационной вилки в присутствии сшивающих агентов, в частности, FA для SPRTN 5,58 и CPT как для FAM111A, так и для SPRTN 51 .Истощение FAM111A, по-видимому, не снижает скорость вилки в неизменных условиях, в отличие от мутации SPRTN 5,51,59,60,61 . Таким образом, FAM111A может вступить в игру, когда перегрузка DPC превышает емкость SPRTN, которая выражается на низких уровнях. В настоящее время такое взаимодействие носит чисто умозрительный характер. Интересно, что FAM111A KO, но не SPRTN. гипоморфные клетки чувствительны к ингибиторам PARP-1, которые, как было показано, улавливают PARP в ДНК, предполагая, что некоторые протеазы DPC могут иметь предпочтение для определенных субстратов 51 .

Регулирование протеаз DPC с помощью посттрансляционных модификаций

Посттрансляционные модификации (PTM) обладают большим регуляторным потенциалом, и большинство обсуждаемых здесь протеаз могут связывать убиквитин через убиквитин-связанный домен (UBA) или убиквитин-связывающий цинковый палец (UBZ) или SUMO (Small ubiquitin-like modifier) ​​через SUMO-взаимодействующий мотив (SIM) (рис. 2). Обработка клеток агентами, индуцирующими DPC, такими как FA и 5-azadC, индуцирует сигнальные каскады, которые завершаются модификацией сшитых белков убиквитином и SUMO 42,62,63 .Мы можем предсказать, что вербовка или постоянство на месте повреждения модулируется PTM. GCNA, например, локализуется в фокусах DNMT1, которые образуются после обработки 5-azadC; это перемещение зависит от SUMOylation и SIM-кодов GCNA 42 (рис. 2). SPRTN образует ядерные очаги после воздействия FA и не может этого сделать при фармакологическом ингибировании пути убиквитилирования 42,62 . Еще предстоит продемонстрировать, зависит ли это перемещение от УБЗ. Это первоначальное свидетельство, подтвержденное преобладанием SUMO-взаимодействующих и ubiquitin-взаимодействующих доменов, доказывает, что протеазы DPC обладают потенциалом для регулирования посредством взаимодействия с посттрансляционно модифицированными белками.

Протеазы DPC могут быть изменены в нормативных целях. SPRTN существует в моноубиквитилированной форме, но воздействие FA ведет к его деубиквитилированию - два разных исследования идентифицировали деубиквитилирующие ферменты VCPIP и USP11 - и ацетилированию, чтобы обеспечить рекрутирование на хроматин 4,64,65 .

Wss1 и SPRTN взаимодействуют с АТФазой Cdc48 / p97, также известной как валозин-содержащий белок (VCP) у млекопитающих, через SHP (супрессор PP1 с высокой копией) и мотив, взаимодействующий с VCP (VIM) 3,36,66 , 67,68 (рис.2). Cdc48 / p97 представляет собой убиквитин-зависимый и SUMO-зависимый шаперон, действующий со специфическими кофакторами для разворачивания субстратов для протеасомной деградации или разборки из различных макромолекул 69,70 . Разворачивающая активность p97 непосредственно способствует репарации Topo-1cc, в которую p97 рекрутируется через его новый кофактор TEX264 (Testis Express 264) перед SPRTN-опосредованным протеолизом 68 . Остается установить, являются ли и как развороты конститутивным требованием репарации протеолиза DPC.

DPC протеазы и репликация ДНК

DPC могут останавливать репликативный комплекс ДНК-геликазы CMG (Cdc45-Mcm2-7-Gins) и / или ДНК-полимеразу во время репликации ДНК, в зависимости от их размера и местоположения (ведущая или отстающая цепь) 33 , 71 (рис.1). Активно реплицирующиеся клетки более восприимчивы к FA и CPT, чем нереплицирующиеся клетки 5,72,73 . Если их не исправить, эти препятствия репликации могут вызвать длительное срывание вилки, которое приводит к коллапсу вилки, образованию двухцепочечных разрывов (DSB) и геномной нестабильности 74 .

В дрожжах, Wss1 был предложен для обеспечения завершения репликации ДНК после воздействия FA 3 , а Ddi1 рекрутируется в сайт повреждения для удаления модельного DPC в синхронизированных S-фазных дрожжевых клетках 45 . Однако репарация DPCs зависимым от репликации ДНК способом была более прямо показана для SPRTN как в человеческих клетках 5 , так и в экстракте яиц Xenopus 75,76 .

В соответствии с репарацией в S-фазе уровни SPRTN выше в фазе S / G2 - из-за APC (комплекса, стимулирующего анафазу) -Cdh2-зависимой деградации в фазе G1 66 - когда он локализуется непосредственно на вилке репликации 5, 57 .SPRTN взаимодействует с PCNA через PIP (PCNA-взаимодействующий белок) -box (рис. 2), который необходим для набора SPRTN в репликационную вилку. Вариант усечения, лишенный C-конца (и, следовательно, PIP-бокса), все еще локализуется в зарождающейся ДНК в iPOND (выделение белков на зарождающейся ДНК) в экспериментах 57 и восстанавливает длину волокна ДНК 60 . Таким образом, неясно, как SPRTN взаимодействует с аппаратом репликации для восстановления DPC.

In vitro процессинг субстрата с помощью SPRTN наиболее эффективно стимулируется оцДНК - с потенциалом образования шпилек - или структурами дцДНК с зазубринами или промежутками, близкими к сшитому белку 4,37,38 .Это согласуется с результатами, полученными в экстрактах яиц Xenopus с использованием плазмиды DPC, где SPRTN расщепляет модельный DPC без продолжающейся репликации, когда есть разрыв в комплементарной нити ДНК 75 . Во время репликации ДНК в клетках разобщение между геликазой и застопорившейся ДНК-полимеразой раскрывает оцДНК и генерирует «гибрид» дцДНК / оцДНК, который совместим с моделью in vitro. Этот специфический контекст ДНК предположительно защищает несшитые ассоциированные с хроматином белки от активности SPRTN 38 .

GCNA также активен в S-фазе. Его роль в синтезе ДНК подтверждается стрессом репликации (образование фокусов RPA / γh3Ax) в митотически активных половых клетках мутантов GCNA мух и червей 40 , а также тем фактом, что компоненты Mcm2-7 геликазы CMG сложная фигура среди DPC в GCNA мутантных эмбрионах мух 40 . Другое исследование связывает GCNA с разрешением перекрестных связей DNMT1, хотя это было показано с эктопически экспрессируемой GCNA в соматических клетках человека 42 .Сшивки DNMT1 образуются позади репликационной вилки, когда DNMT1 рекрутируется на вновь синтезированную ДНК для восстановления паттерна метилирования ДНК, где он может сшиваться в присутствии 5-azadC. Остается определить, нуждается ли эффективная репарация поперечных связей DNMT1 в каталитической активности GCNA.

Уровни FAM111A повышаются в поздней фазе S и остаются высокими во время G2 / M 48 . FAM111A взаимодействует с PCNA через PIP-бокс (рис. 2) 50,52 . Неясно, в какой степени истощение FAM111A нарушает репликацию ДНК.Исследования внедрения EdU дали противоречивые результаты 50,52,61 . Анализы расчесывания ДНК в отсутствие экзогенного повреждения либо показали отсутствие уменьшения длины растущей ДНК в FAM111A-истощенных клетках, либо небольшое увеличение длины тракта, чтобы компенсировать уменьшение исходной активности 51,61 . Вместо этого FAM111A KO снижает скорость репликации при лечении ингибиторами CPT и PARP и увеличивает клеточную чувствительность к этим ядам 51 .Соответственно, фокусы Topo-1cc накапливаются в KO-клетках; интактный PIP-бокс и интактный домен протеазы необходимы для спасения этих фенотипов 51 . Хотя протеолиз Topo-1 in vitro до сих пор не был продемонстрирован, FAM111A может потребоваться для устранения барьеров репликации. В этом отношении степень совпадения с SPRTN еще предстоит определить.

Поразительно, что сверхэкспрессия FAM111A вызывает включение EdU и дефекты клеточного цикла и, следовательно, увеличивает скорость повреждения ДНК и апоптоза; это, вероятно, связано с неспецифическим расщеплением белков репликационной вилки, например.g., PCNA и RFC (фактор репликации C) 50,52,61,77 . Однако сверхэкспрессия мутированного варианта PIP-box повторяет эти фенотипы до некоторой степени, утверждая, что связывание с PCNA может не быть причиной проблем репликации 50,52,61 . Эти дефекты репликации усугубляются сверхэкспрессией вариантов FAM111A, несущих болезнетворные мутации (синдром Кенни-Каффи тип 2, см. Ниже и рис. 2) 52,61,77 . Сверхэкспрессия мутантных вариантов FAM111B, вызывающих ПОИКТМП (рис.2), в значительной степени имитирует фенотип сверхэкспрессии FAM111A 52 . В обоих случаях сопутствующие мутации в доменах протеаз устраняют эти дефекты, показывая, что наблюдаемые фенотипы являются прямой причиной FAM111A / B-зависимого протеолиза 52 . Эти данные свидетельствуют о том, что нарушение регуляции ферментативной активности FAM111A / B пагубно для клеток. Таким образом, жесткая регуляция уровня и активности этих протеаз имеет решающее значение для успешного завершения репликации ДНК.

Нисходящий путь и синтез ДНК трансфузии

Синтез ДНК трансфузии (TLS) - это механизм устойчивости к повреждениям, при котором обычная ДНК-полимераза заменяется подверженной ошибкам полимеразой TLS, которая обходит поражение.Этот переключатель зависит от PCNA и его убиквитилирования с помощью убиквитинлигазы E3 Rad18 78 . SPRTN был связан с регулированием TLS после УФ-повреждения до того, как была установлена ​​его роль в восстановлении DPC 66,67,79,80,81,82 . SPRTN взаимодействует как с PCNA, так и с убиквитином, но не совсем ясно, как SPRTN регулирует TLS. Некоторые исследования предполагают, что это положительный регулятор TLS 79,81,82 , в то время как другие предполагают, что SPRTN предотвращает УФ-индуцированный TLS-зависимый мутагенез 66,67,80 .

Хотя регулирование TLS с помощью SPRTN изначально было связано с репарацией УФ-повреждений, вероятно, что обход остаточного пептида после объемного протеолиза DPC также требует TLS (Fig. 1). Некоторые доказательства подтверждают это: (i) УФ-свет может сшивать белки с ДНК 83,84,85 ; (ii) анализ эпистаза показывает, что Rad18 и SPRTN работают вместе 58 ; (iii) в экстрактах яиц Xenopus TLS-полимеразы необходимы для завершения репликации плазмиды, несущей модель DPC, после расщепления SPRTN 75 ; (iv) в дрожжах делеция WSS1 снижает частоту мутаций после FA 3 .Следовательно, TLS может действовать сразу после протеолиза DPC, чтобы избежать остановки вилки, поскольку мутации по-прежнему более желательны, чем коллапс репликационной вилки.

Есть один случай, когда накопление мутаций может быть полезным. Это гипермутация локусов иммуноглобулина. Было показано, что SPRTN способствует мутациям (ДНК-полимераза эта и дзета-зависимая) в абазических сайтах и ​​опосредованной переключением матрицы конверсии гена во время диверсификации гена иммуноглобулина в куриных В-клетках 86 .Примечательно, что абазические сайты являются обычным источником образования DPC, а фенотип гипермутации согласуется с TLS, действующим ниже протеолиза DPC. В соответствии с этим, более низкие частоты мутаций в локусе иммуноглобулина наблюдаются в SPRTN-истощенных клетках 86 . Это предполагает, что SPRTN играет роль в создании разнообразия репертуара иммуноглобулинов и в пути устойчивости к повреждению ДНК, когда вилки репликации ДНК останавливаются.

Восстановление DPC вне фазы S

Несмотря на многочисленные доказательства, связывающие SPRTN с протеолизом DPC, связанным с репликацией, не исключена независимая от репликации функция SPRTN 4,5 . SPRTN мутации или недостаточность проявляются в гепатоцеллюлярной карциноме 57,60 . Печень может быть больше подвержена воздействию DPC, чем другие органы, потому что вдыхаемые и проглоченные соединения могут катаболизироваться в формальдегид. Однако подавляющее большинство гепатоцитов находятся в состоянии покоя 87 , поэтому вполне вероятно, что SPRTN работает за пределами S-фазы, и что неправильное функционирование может привести к раку. Также возможно, что повреждение печени, наблюдаемое у пациентов с мутацией SPRTN или гипоморфных мышей SPRTN , инициируется во время S-фазы эмбриогенеза, но этот дефект проявляется позже.

Личинки червей, задержанные голодом, где репликация не происходит (клетки задерживаются в G1 / S), чувствительны к формальдегиду 4 , что указывает на то, что затронуты процессы, отличные от синтеза ДНК. Другой пример активности SPRTN вне S фазы происходит от Drosophila . Экспрессия мутировавшего mh (гомолог SPRTN) из материнского генома в зиготе приводит к потере отцовской ДНК во время первого митотического деления и приводит к летальности гаплоидных эмбрионов - отсюда и название mh, «материнский гаплоид» 88 , 89 .Эта потеря вызвана отсутствием конденсации отцовской ДНК во время митоза, и она по своей природе не связана с репликацией ДНК и фазой S 88 . Ремоделирование отцовской ДНК все еще зависит от каталитической активности mh, но механизм неясен 88,89 .

GCNA также работает вне фазы S. Его экспрессия достигает пика в митозе, где он локализуется на хромосомах 41 . Topo-2cc являются известными целями GCNA 40,41 . Topo-2ccs в изобилии в митозе, потому что активность Topo-2 необходима для разделения сестринских хроматид.Поддерживая роль GCNA в репарации Topo-2cc, GCNA и Topo-2 физически взаимодействуют и колокализуются, а мутантные черви чувствительны к этопозиду, но не к камптотецину 41 .

В целом эти данные подтверждают, что активность протеазы DPC важна для поддержания целостности генома во время репликации ДНК, а также вне S-фазы.

DPC протеазы и транскрипция

DPC также являются потенциальными препятствиями для транскрипции 20 . Хотя остановка транскрипции и мутагенез могут угрожать стабильности генома 90 , влияние DPC на прогрессирование РНК-полимераз в значительной степени игнорируется.

Появились некоторые доказательства связи протеаз DPC и транскрипции. Rpb1, самая большая и каталитическая субъединица РНК-полимеразы II, разрушается через Ddi1 и Wss1 после воздействия HU или УФ-света 45 . Обе протеазы взаимодействуют с Rpb1. Однако это доказательство не дает достаточных доказательств того, что Ddi1 и Wss1 нацелены на Rpb1 как сшитый белок. Его деградация может быть следствием остановки транскрипции из-за препятствий перед РНК-полимеразой II. Фактически, при этих обстоятельствах было описано, что деградация Rpb1 зависит от убиквитин-протеасомной системы, АТФазы Cdc48 / p97 и SUMO 91,92 .В любом случае застопорившийся, несшитый Rpb1 будет в равной степени «подходящим» для деградации протеазами DPC, поскольку существуют другие «не-DPC» субстраты, которые будут обсуждаться позже в этом обзоре.

Связь между транскрипцией и FAM111A в клетках человека также существует. Сверхэкспрессия FAM111A снижает уровни Rpb1 в хроматине и, следовательно, включение ЕС 52 . FAM111A также взаимодействует с Rpb1 при сверхэкспрессии 52 . Однако неясно, связаны ли эти фенотипы с прямым протеолизом Rpb1.

DPCs и протеасома

Наиболее изученным протеолитическим механизмом в клетке является протеасома 26S (далее протеасома), которая расщепляет белки, которые ранее были модифицированы убиквитином и не были структурированы развёртыванием 93,94 . Неудивительно, что протеасомная активность была протестирована в отношении DPC 26 . Участие протеасомы подразумевает, что DPC д. Быть модифицирован убиквитином. Ранние источники доказательств показали, что ингибирование протеасом задерживает деградацию Topo-1/2 после воздействия Topo-1 и -2 ядов, предполагая, что протеасома необходима для репарации Topo-cc 95,96,97 .Однако эти начальные эксперименты не подтвердили образование убиквитилированных Topo-ccs. Убиквитилирование топоизомеразы было показано в экстрактах цельных клеток - а не на хроматине или Topo-ccs - и не было увеличения состояния убиквитилирования топоизомеразы после протеасомного ингибирования 95,97 . Более того, в этих исследованиях использовались очень высокие дозы СРТ (диапазон мкМ) 96,97 , которые сшивают 90% Topo-1 98 и могут вызвать перегрузку Topo-1cc сверх репарационной способности другого, репликационного - зависимые, протеазы.

Более поздние исследования прямо показали, что как ферментативные, так и неферментативные DPC модифицируются убиквитином 14,42,62,63,75 . Однако, ведет ли эта модификация к протеасомной деградации, кажется спорным, поскольку убиквитилирование скорее может иметь сигнальную роль 62 .

Сшитые белки могут быть одновременно модифицированы убиквитином и SUMO (SUMO-1 или SUMO-2/3) 42,62,63,75 . Модификация посредством SUMO-2/3 перед убиквитилированием указывает на участие SUMO-нацеленных ubiquitin ligases (STUbLs), которые убиквитилируют модифицированные SUMO субстраты для протеасомной деградации 42,63 .Однако были описаны сценарии, в которых эти две модификации независимы, хотя функция DPC SUMOylation в этих случаях остается неясной 62,75 .

S.cerevisiae Ddi1 - адаптер протеасомы 99 (рис. 2). UBL Ddi1 связывает протеасомную субъединицу Rpn1 100,101 и, в отличие от обычных доменов UBL, он также связывает убиквитин вместе с UBA 43,102 . Однако нет никаких доказательств того, что Ddi1 функционирует в репарации DPC с помощью протеасомы.Фактически, сверхэкспрессия мутантных версий, лишенных доменов UBL и UBA, дополняет делецию DDI1 в экспериментах по чувствительности FA, тогда как мутация предполагаемого каталитического домена не вызывает 45 . Другой сценарий весьма вероятен для человеческих гомологов DDI1 и DDI2. DDI1 / 2 связывают протеасомы через свои UBL 43,44 (рис. 2). DDI1 / 2 рекрутирует протеасомы на остановившихся вилках репликации для удаления RTF2, чья персистентность предотвращает перезапуск вилки после HU и вызывает нестабильность хромосомы 44 .

Что касается протеасомозависимой репарации DPC во время репликации, эксперименты с экстрактами яиц Xenopus предоставили наиболее убедительные доказательства 75,76 . Напротив, в клетках млекопитающих убиквитилирование Topo-ccs посредством STUbL RNF4 перед протеасомной деградацией не зависит от репликации 63 . В недавнем отчете утверждается, что фермент HMCES перекрестно связывается с базовыми сайтами перед вилкой репликации. Таким образом, HMCES защищает базовые сайты от репликации TLS-полимеразами и предотвращает мутагенез 14 .Сшивки HMCES убиквитилированы и процессируются протеасомой, но роль других протеаз не проверялась 14 . Хотя физиологическое сшивание должно происходить во время синтеза ДНК, чтобы предотвратить переключение на полимеразы TLS, не было установлено, что репарация HMCES-DPC протеасомой происходит во время репликации. Пострепликативная репарация вероятна, поскольку (i) HCMES-DPC как таковой представляет собой препятствие для прогрессирования ДНК-полимеразы и (ii) протеолиз протеасомой, вероятно, оставит пептид, который может останавливать ДНК-полимеразу.В любом случае должен существовать механизм толерантности, отличный от TLS, чтобы обойти DPC или остаточный пептид (например, переключение матрицы). Следовательно, пострепликативный протеасомозависимый протеолиз в этом случае остается формальной возможностью.

В заключение, связанный с репликацией протеолиз с помощью большого комплекса, такого как протеасома, остается вопросом будущих исследований на клетках млекопитающих. Например, будет информативным определить, появляются ли субъединицы протеасомы в формирующемся хроматине после обработки агентами, индуцирующими DPC (например,g., iPOND), поскольку оценка белков, обогащенных на остановившихся вилках, была полезна для других видов репликационного стресса 103 .

Протеазы DPC при обработке несшитых прочно связанных субстратов

Масс-спектрометрия была проведена на DPC, выделенных из клеток, лишенных SPRTN 5 и GCNA 40 для идентификации наиболее распространенных сшитых белков. Эти скрининги доказали, что топоизомеразы, гистоны и субъединицы Mcm геликазного комплекса CMG являются основными DPC в SPRTN-истощенных клетках и GCNA KO мух 5,40 .Ожидается, что в таких скринингах появятся белки, связывающие нуклеиновые кислоты. 5 , поскольку белки, действующие вблизи ДНК, скорее всего, сшиты. Однако эксперименты по расщеплению in vitro в основном проводятся на субстратах, которые имеют склонность к связыванию ДНК, но не сшиты с ДНК 3,4,5,6,37 . Следовательно, для расщепления необходима ассоциация ДНК, а не сшивание как таковое. Недавние исследования доказали, что это верно и для клеток. Три исследования ниже показывают, что протеазы нековалентно обрабатывают ДНК-ассоциированные белки для защиты клеток от ошибок репликации ДНК.

Гистоны: Недавнее исследование постулирует, что Wss1 деградирует несобранные, но нековалентно связанные гистоны во время стресса репликации 104 . Эта активность Wss1 будет защищать клетки от неспецифического связывания избыточных гистонов с оцДНК, накапливающейся после воздействия HU, что может мешать метаболизму ДНК 104 (фиг. 4A). Чувствительность мутантных дрожжевых клеток wss1 к HU значительно усиливается за счет сопутствующей делеции DDI1 , а каталитически неактивный Ddi1 не спасает выживание клеток 45,46 .Таким образом, протеаза Ddi1, как и Wss1, может быть необходима, чтобы справиться со стрессом репликации за пределами DPC. Что еще интереснее, исследования комплементации у дрожжей подтверждают, что hDDI1 / 2 сохраняют ту же функцию 46 .

PARP-1: Плотно связанные белки могут быть так же опасны, как DPC, для развития репликационной вилки 105 . Этот сценарий хорошо иллюстрируется захватом PARP-1. PARP-1 - это фермент, участвующий в репликации ДНК и многих путях репарации ДНК 106,107 .PARP-1 катализирует образование цепей поли-АДФ-рибозы (PAR) - реакцию, известную как PARylation, - которая задействует другие репарационные белки; Само-PARylation запускает электростатическую диссоциацию хроматина, позволяя протекать реакции репарации 106 . Фармакологическое ингибирование приводит к тому, что PARP становится прочно связанным - или захватывается - на хроматине из-за дефектного самопарилирования. Сохранение хроматина из-за ингибиторов PARP более проблематично, чем каталитическое ингибирование как таковое 108 .Фактически, захваченный PARP-1 может вызывать коллапс репликационной вилки и DSB и может убить BRCA -дефицитных клеток, стратегия, которая используется для лечения онкологических пациентов с BRCA мутациями 109 . Истощение FAM111A повышает чувствительность клеток к нирапарибу и талазопарибу 51 , двум ингибиторам PARP с высокой улавливающей способностью 108,110 . Обработка нирапарибом снижает скорость репликационной вилки в клетках, истощенных по FAM111A, и вызывает репликационный стресс.Восстановление дефекта репликации зависит от каталитических остатков FAM111A, PIP-бокса и связывания ДНК, подразумевая, что FAM111A использует свою протеолитическую активность для устранения препятствий, создаваемых захваченным PARP-1 для репликационных вилок 51 (рис. 4B). Остается установить, участвуют ли другие протеазы в удалении прочно связанных белков.

Chk1: Деградация несшитого субстрата повторяет удаление DPC: в любом случае протеолиз устраняет потенциальные препятствия для репликации ДНК и метаболизма, которые угрожают жизнеспособности клеток 51,104 .Поразительным контрастом является расщепление киназы контрольной точки Chk1 с помощью SPRTN во время синтеза ДНК 59 . Во время S фазы SPRTN расщепляет Chk1 на хроматине в слабо структурированной области на C-конце и высвобождает усеченные N-концевые фрагменты Chk1 с более сильной киназной активностью, чем полноразмерный белок 59 (Fig. 4C). Таким образом, SPRTN обеспечивает базальную и физиологическую активацию Chk1, чтобы поддерживать прогрессию репликации ДНК в отсутствие экзогенного повреждения, т.е. в отсутствие нарушений, которые вызывают накопление оцДНК и устойчивый ATR-зависимый каскад активации Chk1 59,111 .Сверхэкспрессия N-концевых фрагментов Chk1 восстанавливает нормальную репликацию ДНК в SPRTN-истощенных клетках (т.е. скорость репликационной вилки и запуск ориджина) и частично устраняет дефекты развития SPRTN -дефицитных эмбрионов рыбок данио 59 .

Помимо раскрытия важной роли Chk1 во время невозмущенной репликации, это исследование также показывает, что функция протеаз DPC выходит далеко за рамки протеолиза барьеров репликационной вилки.

DPC протеазы и болезни

Дефектная репликация ДНК, часто называемая стрессом репликации ДНК, является одной из основных причин рака. 112,113,114 .Стресс репликации ДНК может быть вызван препятствиями перед вилкой репликации, например, вызванными сшитыми или прочно связанными белками. Поскольку активность протеаз DPC связана с репликацией ДНК, существует сильная ассоциация между дефектными протеазами DPC и заболеваниями человека 40,57,60 .

Синдром Рюйса-Алфса (RJALS)

Двуаллельные и моногенные мутации в SPRTN вызывают редкое аутосомно-рецессивное прогероидное заболевание, известное как RJALS 60 .Это было первое заболевание, связанное с дефектной репарацией протеолиза DPC. Мутации с потерей функции, выявленные у пациентов до сих пор, представляют собой миссенс-мутацию, которая генерирует каталитически неактивный вариант SPRTN-Y117C, и несмысловые мутации, которые генерируют усеченный SPRTN, SPRTN-ΔC (рис.2), который сохраняет частичную функциональность. из-за интактной протеазной активности, но с дефектной клеточной локализацией 4,5,57,60 . У пациентов с RJALS проявляются признаки преждевременного старения, включая катаракту, поседение волос, липодистрофию, и у них развивается гепатоцеллюлярная карцинома с ранним началом (ГЦК) 60 .Эти фенотипы были повторены у гипоморфных мышей SPRTN 57,115 и окончательно доказывают, что дефектный SPRTN сам по себе ответственен за фенотип RJALS.

Старение и рак кажутся противоречивыми проявлениями, но на самом деле это два результата одних и тех же основных клеточных дефектов - накопление повреждений ДНК и геномная нестабильность 116,117 . Клетки пациентов с RJALS (линии лимфобластоидных клеток и фибробласты, полученные от пациентов) демонстрируют стресс репликации ДНК, утечку G2 / M, повышенное количество DSB, хромосомные аберрации и повышенный уровень общих DPC.Неясно, почему у людей и мышей развивается ГЦК, в то время как остальная часть тела стареет.

Синдром Кенни-Каффи типа 2 (KCS2) и дисплазия тонкой кости (GCLEB)

Мутации FAM111A вызывают KCS2, редкое аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся низким ростом, гипопаратиреозом, гипокальциемией и аномальным развитием костей. У пациентов с KCS2 нет предрасположенности к развитию рака 118119 . Гетерозиготные мутации в FAM111A также были обнаружены у пациентов с GCLEB или остеокраниостенозом 119 .GCLEB смертелен для новорожденных из-за серьезных аномалий скелета.

Мутации, вызывающие KCS2 и GCLEB, изменяют протеолитическую активность FAM111A. Замена R569 на гистидин (H) является повторяющейся мутацией в KCS2 118,119 и находится в непосредственной близости от каталитического остатка S541 (рис.

Comments |0|

Legend *) Required fields are marked
**) You may use these HTML tags and attributes: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <s> <strike> <strong>
Category: Ремонт