АВТО БЛОГ YAMAHA-VOLGA.RU

Схематическое изображение экспрессионной кассеты E. coli ( A ) и синтезированных полипептидов, образующих BS1.5 или биспецифические диатела BS1.5H ( B ). A , кассета экспрессии в векторе pET-ER, которая кодирует одиночное сообщение РНК, генерируемое РНК-полимеразой Т7 через промотор Т7. Это сообщение содержит два сайта связывания рибосом (RB) и кодирующие последовательности для двух гетерологичных полипептидов. B , рисунок диатела BS1.5 (или BS1.5H), образованного парой гетерологичных полипептидов [679V _H (G ₄ S) hMN-14V _K и hMN-14V _H (G ₄ S) 679V _K ] и обладают по одному сайту связывания каждый для CEA и HSG.

Схематическое изображение экспрессионной кассеты E. coli ( A ) и синтезированных полипептидов, которые образуют трехвалентный биспецифический BS6 ( B ). A , кассета экспрессии в векторе pET-ER, которая кодирует одиночное сообщение РНК, генерируемое РНК-полимеразой Т7 через промотор Т7. Это сообщение содержит два сайта связывания рибосом (RB) и кодирующие последовательности для двух гетерологичных полипептидов. B , рисунок структуры трехвалентного биспецифического белка BS6, имеющего один сайт связывания для HSG и два сайта связывания для CEA.

Схематическое изображение экспрессионной кассеты E. coli ( A ) и синтезированных полипептидов, которые образуют трехвалентный биспецифический BS8 ( B ). A , кассета экспрессии в векторе pET-ER, которая кодирует одиночное сообщение РНК, генерируемое РНК-полимеразой Т7 через промотор Т7. Это сообщение содержит два сайта связывания рибосом (RB) и кодирующие последовательности для двух гетерологичных полипептидов. B , рисунок структуры трехвалентного биспецифического белка BS8, имеющего один сайт связывания для HSG и два сайта связывания для CEA.

Производство и характеристика рекомбинантного bsAb.

Химически компетентные клетки E. coli BL21-pLysS (Novagen) трансформировали плазмидами экспрессии для BS1.5, BS1.5H, BS6 или BS8 в соответствии с рекомендациями производителя. Трансформанты высевали в течение ночи при 37 ° C на чашки с агаром Lennox L, дополненным сульфатом канамицина (100 мкг / мл) и хлорамфениколом (34 мкг / мл). Трансформированные колонии использовали для инокуляции дрожжевых культур бульона Difco 2xYT (Becton Dickinson, Sparks, MD) с добавлением сульфата канамицина (100 мкг / мл) и хлорамфеникола (34 мкг / мл).Культуры встряхивали при 37 ° C до A _{600 нм} 1,6–1,8. К культурам добавляли равный объем 2xYT-среды комнатной температуры с добавлением антибиотиков и 0,8 мкМ сахарозы, которые затем переносили до 20 ° C. После 30-минутного встряхивания при 20 ° C экспрессию индуцировали добавлением изопропил-β-d-тиогалактозида до конечной концентрации 40 мкМ, и инкубацию продолжали при 20 ° C в течение 15-18 часов. Бактерии осаждали центрифугированием при 10000 × g . Осадки клеток замораживали и оттаивали, затем ресуспендировали в буфере для лизиса [2% Triton X-100, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 5 мМ MgSO ₄ , 25 единиц / мл бензоназы и 50 мМ NaH ₂ PO ₄ (pH 8.0)], используя количество, равное 1% от объема культуры. Суспензию гомогенизировали обработкой ультразвуком и осветляли центрифугированием при 40000 × g . Растворимые экстракты загружали на колонки с Ni-NTA-агарозой (Qiagen, Inc., Валенсия, Калифорния), используя ~ 1,0 мл смолы Ni-NTA / литр культуры. Колонки промывали буфером, содержащим 20 мМ имидазола, и элюировали 250 мМ имидазола. Элюат Ni-NTA загружали непосредственно в анионообменную колонку Q-Sepharose (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) и собирали проточную фракцию, содержащую продукты.Выход BS1,5 и BS1,5H составлял ~ 0,5 мг / л культуры. Выходы BS6 и BS8 составили ∼50 и 20 мкг / л соответственно.

ВЭЖХ с вытеснением по размеру выполняли на приборе Beckman System Gold Model 116 с колонкой Bio-Sil SEC 250 (Bio-Rad, Richmond, CA). Для калибровки колонки использовались различные стандарты, включая hMN-14 IgG ( M _r ∼150 000), hMN-14 Fab ′ ( M _r ∼50 000), модифицированный N -этилмалеимидом, hMN-14 F (ab ′) ₂ ( M _r ∼100000), диатело hMN-14 ( M _r 53000) и триабоди hMN-14 ( M _r 80 000) .

Анализ BIAcore.

Систему BIAcoreX (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) использовали для анализа связывающих свойств биспецифических белков. Кинетику связывания BS1.5 оценивали с использованием сенсорного чипа низкой плотности, сопряженного с HSG, подготовленного в соответствии с инструкциями производителя. Сенсограммы связывания получали для BS1,5 и hMN-14 × m679 при концентрациях от 0 до 54 нМ, и полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения BiaEvaluation с использованием модели связывания Ленгмюра 1: 1.Свойства биспецифического связывания каждого агента анализировали с помощью BIAcore с помощью биосенсорного чипа высокой плотности, сопряженного с HSG, подготовленного в соответствии с инструкциями производителя. Пятьдесят мкл BS1.5, BS1.5H, BS6 или BS8 (каждый по 1,0 мкг / мл) были предварительно связаны с сенсорным чипом перед инъекцией 100 мкл WI2 (20 мкг / мл), крысиного моноклонального антиидиотипа. антитело, высокоспецифичное к hMN-14 (34) , был применен. Растворимый CEA (Scripps Laboratories, La Jolla, CA) также использовался вместо WI2 и дал аналогичные результаты.

ELISA.

Конкурентные эксперименты ELISA были выполнены для демонстрации связывания BS1.5 или BS1.5H с CEA через его сайт связывания hMN-14. Планшеты для микротитрования покрывали растворимым СЕА в количестве 0,5 мкг / лунку. BS1.5, BS1.5H или hMN-14 × m679 в концентрациях от 4 до 500 нМ позволяли конкурировать за связывание CEA с hMN-14 IgG, конъюгированным с пероксидазой хрена (1,0 нМ). Поглощение измеряли при 415 нм с помощью микротитровального ридера после добавления таблеток 2,2′-азино-бис (3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты (Sigma, St.Луис, Миссури).

Определение иммунореактивности.

Иммунореактивность BS1.5, BS1.5H или hMN-14 × m679 для CEA оценивали с помощью эксклюзионной ВЭЖХ путем измерения доли радиоактивного йода образца, которая сдвигается в присутствии избытка CEA в сторону более короткого времени удерживания как результат привязки к CEA. Способность BS1.5, BS1.5H или hMN-14 × m679 связываться с радиоактивно меченным пептидом аналогичным образом была продемонстрирована с помощью эксклюзионной ВЭЖХ, отмечая сдвиг радиоактивно меченного пептида в сторону более короткого времени удерживания при добавлении биспецифической конструкции.

Самок голых мышей NCr массой 19–21 г (Taconic, Germantown, NY), несущих s.c. CEA-положительный GW-39 (35) ксенотрансплантаты рака толстой кишки человека вводили внутривенно. с ¹³¹ I-меченым BS1.5, полученным йодогенным методом (36) оценить его биораспределение. Для исследований с предварительным нацеливанием внутривенно вводили 8 мкг BS1.5 или BS1.5H (каждая дорожка помечена как ¹²⁵ I или ¹³¹ I). а затем через 8 и 15 часов (BS1.5 и BS1.5H соответственно), IMP-241 (15 пмоль), меченный 10 мкКи ¹¹¹ In в соответствии с ранее опубликованными методами (28) был введен. Биораспределение ¹¹¹ In-IMP-241 исследовали через 3 и 24 часа после его введения.

Результаты

Дицистронная экспрессионная кассета, показанная на рис. 1 <$ REFLINK> for BS1.5 кодирует два гетерологичных полипептида, которые предназначены для спаривания друг с другом и образования по одному функциональному сайту связывания для CEA и HSG посредством обмена доменов (37) .Подобная кассета дицистронной экспрессии была сконструирована для BS1.5H путем замены вариабельных доменов m679 в кассете дицистронной экспрессии BS1.5 гуманизированными версиями (E. Rossi et al ., Неопубликованные данные). Мы создали кассеты дицистронной экспрессии для двух новых типов трехвалентных биспецифических конструкций, разумно соединив три вариабельных домена со спейсерами соответствующей длины в каждом из двух цистронов, как показано на примере BS6 (рис. 2) <$ REFLINK> и BS8 (рис.3) <$ REFLINK> . Каждый из четырех белков получали из растворимой фракции и очищали аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом с использованием Ni-NTA с последующей анионообменной хроматографией на Q-сефарозе. Как показано на рис. 4 <$ REFLINK> , BS1,5H давал единственный пик на SE-HPLC, и наблюдаемое время удерживания соответствовало ожидаемому молекулярному размеру M _r ~ 54000, что указывает на образование димера. Аналогичные чистота и время удерживания по ВЭЖХ были получены для BS1.5 (данные не показаны). Время удерживания, наблюдаемое для BS6 или BS8, также соответствовало ожидаемому молекулярному размеру M _r ∼81000, что указывает на образование димера.

Профиль гель-фильтрации BS1,5H после очистки аффинной хроматографией с иммобилизованным металлом и хроматографией на Q-сефарозе.

Дополнительные характеристики были предоставлены экспериментами BIAcore для демонстрации свойств биспецифического связывания, как показано на рис.5 <$ REFLINK> для BS1.5H и BS6. Каждый белок прочно связывается с иммобилизованным HSG на сенсорном чипе. Белки, связанные с HSG, были способны захватывать добавленные впоследствии CEA или WI2, демонстрируя, что они могут одновременно связывать оба антигена. Если связыванию WI2 позволяют достичь насыщения, можно определить стехиометрию связывания. Дополнительное увеличение RU в результате связывания WI2 сравнивали с начальным увеличением RU биспецифического белка при связывании с сенсорным чипом HSG.Поскольку каждое увеличение уровня RU прямо пропорционально связанной массе, молярное соотношение связывания WI2: bsAb можно рассчитать по формуле (RU _WI2 / RU _bsAb ) × (MW _bsAb / MW _WI2 ) . Поскольку WI2 двухвалентен, ожидается, что 1 моль WI2 свяжет два моля BS1,5 или BS1,5H, каждый из которых является одновалентным для CEA; поэтому теоретическое максимальное молярное отношение связывания WI2: bsAb должно составлять 0,5. Экспериментально определенные молярные отношения связывания для BS1,5, BS1.5H и hMN-14 × m679 приблизились к теоретическому максимуму 0,5 (таблица 1) <$ REFLINK> . BS6 и BS8 были разработаны так, чтобы быть двухвалентными для CEA (и одновалентными для HSG) и, как таковые, должны связывать WI2 с молярным соотношением 1: 1. Действительно, экспериментально определенные молярные отношения связывания WI2 с BS6 или BS8 оказались между 0,8 и 0,9, что также приближается к теоретическому максимуму 1,0 (Таблица 1) <$ REFLINK> . Эти результаты BIAcore в сочетании с данными ВЭЖХ демонстрируют, что каждая из четырех конструкций дает белок, который имеет структуру и функции, как задумано.

сенсограммы BIAcore, показывающие одновременное связывание HSG и CEA для BS1.5H ( A ) и BS6 ( B ). BS1,5H или BS6 (~ 50 нг) загружали на сенсорный чип высокой плотности, связанный с HSG, а затем WI2 (2 мкг) позволяли связываться с иммобилизованным биспецифическим белком. Стрелки указывают время впрыска.

Экспериментальные и теоретические молярные отношения связывания WI2 с bsAb

Параметры привязки HSG для BS1.5 и hMN-14 × m679 были проанализированы BIAcore и приведены в таблице 2 <$ REFLINK> . Константа диссоциации (K _d ) для HSG, определенная для BS1,5, была аналогична таковой для hMN-14 × m679. На основании качественного анализа BIAcore (данные не показаны) было также обнаружено, что сродство BS1,5H к HSG аналогично сродству BS1,5, что указывает на то, что гуманизация вариабельных доменов m679 не изменяет измеримым образом аффинность связывания HSG. Как показано на рис. 6 <$ REFLINK> , конкурентные эксперименты ELISA продемонстрировали, что BS1.5 и hMN-14 x m679 имели аналогичную аффинность связывания (K _d , ∼10 нм) для CEA. В отдельном конкурентном эксперименте ELISA была измерена аффинность связывания BS1,5H с CEA, которая также составила ~ 10 нм.

Графическое представление результатов конкурентного эксперимента ELISA. Конъюгированный с пероксидазой хрена hMN-14 IgG (1 нМ) смешивали либо с BS1.5, либо с hMN-14 × m679 в концентрациях от 4 до 500 нМ перед инкубацией в покрытом CEA (0.5 мкг / лунку) лунки ELISA. Процент ингибирования нанесен на график в зависимости от концентрации (нМ) образца.

Параметры связывания HSG, определенные BIAcore

Биораспределение BS1.5 оценивали на голых мышах с опухолью GW-39, используя след образца, меченный радиоактивным йодом (иммунореактивность ~ 90%). BS1.5 быстро выводится из крови (рис. 7) <$ REFLINK> , начиная с 15,9 ± 1,3% ID / г в крови через 1 ч, 1,46 ± 0.37% ID / г через 8 часов и 0,26 ± 0,03% ID / г через 24 часа после инъекции. Поглощение опухолью через 1 час составило 7,6 ± 2,1% ID / г, которое снизилось до 4,7 ± 0,7 и 2,8 ± 0,4% ID / г через 8 и 24 часа, соответственно, после инъекции. В почках (данные не показаны на рис. 7 <$ REFLINK> ), поглощение было сначала измерено при 61,5 ± 3,2% ID / г через 1 час, но оно быстро снизилось до 2,5 ± 0,2 и 0,6 ± 0,16% ID / г через 8 и 24 часа после инъекции, что отражает быструю фильтрацию и отсутствие каких-либо значительная реадсорбция радиоактивного йода почками.Сравнимое биораспределение было обнаружено для BS1,5H, показав 3,1 ± 0,7% ID / г в опухоли с 0,36 ± 0,07% ID / г в крови через 18 ч после инъекции.

Биораспределение ¹³¹ I-меченного BS1.5 у голых мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли толстой кишки человека GW-39 (размеры опухолей в среднем от 0,15 до 0,3 г). Столбцы представляют собой стандартное отклонение среднего ( n = от 4 до 5 мышей).

Полезность BS1.5 и BS1.5H для предварительного нацеливания на опухоли оценивали на мышах, несущих опухоль GW-39, с использованием ¹¹¹ In-меченного IMP-241.Первоначально исследования проводились с BS1.5 с использованием нескольких интервалов между пептидом и bsAb, чтобы определить оптимальное время для предварительного нацеливания. На основании нашей предыдущей работы (26 , 28 , 29) соотношение впрыскиваемых моль, равное 10: 1 bsAb: пептид, использовали как для BS1,5, так и для BS1,5H. Как показано в таблице 3 <$ REFLINK> , с пептидом, введенным всего через 8 часов после инъекции BS1.5, поглощение пептида опухолью составляло 10,3 ± 2,7% ID / г через 3 часа после инъекции пептида, при этом соотношение опухоль / кровь превышало 150. Это поглощение составляло ~ 100 раз. выше, чем для одного пептида.Поглощение опухолью снизилось до 6,3 ± 2,2% ID / г через 24 ч после введения пептида, но соотношение T / NT сохранялось на очень высоком уровне. Поскольку до введения пептида прошло больше времени, поглощение пептида опухолью было меньше, чем при 8-часовом интервале, и никаких дополнительных улучшений в отношениях T / NT не наблюдалось с интервалами> 8 часов. Анализ ANOVA, сравнивающий данные аутопсии по поглощению опухолью через 3 часа для трех разных интервалов, показал, что между этими группами было значительное различие ( P = 0.012), причем 8-часовой интервал значительно превышает два других интервала. Использование теста с одним хвостом t для изучения различий в данных по поглощению опухолью через 24 часа показало, что 8- и 12-часовой интервалы существенно не различались ( P = 0,3), но 8- и 12-часовой интервалы интервал был значительно выше, чем 24-часовой интервал (8 против 24 ч, P = 0,01; 12 против 24 ч, P = 0,03). Таким образом, из протестированных интервалов 8-часовой был лучшим для достижения максимального прироста опухоли.Однако, учитывая чрезвычайно высокие отношения T / NT, возможно, можно было ввести пептид даже раньше. Аналогичное исследование было выполнено для BS1,5H, чтобы определить лучший интервал для введения пептида, и был выбран 15-часовой интервал.

Биораспределение ¹¹¹ In-IMP-241 у голых мышей с опухолями GW-39 (размером от 0,15 до 0,3 г), вскрытых через 3 или 24 часа после инъекции пептида

Мышам сделали в / в.инъекция BS1.5 за 8, 12 или 24 ч до инъекции пептида ( n = 4–5 животных / группа).

Результаты предварительного нацеливания с использованием BS1.5 сравнивались с результатами, полученными с помощью hMN-14 × m679 и BS1.5H. Для hMN-14 × m679 24-часовой интервал и молярное соотношение впрыскиваемого bsAb / пептида 10: 1 были определены как оптимальные для предварительного нацеливания (28). . Через 24 часа hMN-14 × m679 обычно имел ~ 0,8% ID / г в крови и ~ 3,0% ID / г в опухоли, что сравнимо с результатами, наблюдаемыми с BS1.5 через 8 часов или BS1.5H через 15 часов. В этих условиях концентрация ¹¹¹ In-IMP-241 в опухоли была одинаковой для каждого из трех агентов предварительного нацеливания. Однако радиоактивность во всех нормальных органах была выше у мышей, предварительно нацеленных на hMN-14 × m679 (рис. 8) <$ REFLINK> . Следовательно, отношения T / NT (Таблица 4) <$ REFLINK> были лучше для двух биспецифических диател.

Сравнение отношений T / NT ^a через 3 часа после ¹¹¹ In-IMP-241

Обсуждение

Медленный клиренс из крови непосредственно радиоактивно меченного интактного IgG приводит к высокой фоновой активности, что снижает количество вводимой радиоактивности.Хотя это не ограничивает успех лечения радиочувствительных гематологических злокачественных новообразований, солидные опухоли потребуют более высоких уровней радиоактивности для достижения значительных противоопухолевых эффектов (2). , 3) . Фрагменты антител, такие как Fab или F (ab ‘) ₂ , выводятся из крови быстрее, чем цельный IgG, что улучшает отношения мишени к фону, но за счет более низкого поглощения радиоактивно меченного антитела опухолью по сравнению с цельным IgG (38) . Хотя фрагменты антител использовались для визуализации (39) и некоторые доклинические исследования показали их терапевтическую эффективность (40) , существует лишь ограниченный интерес к разработке радиоактивно меченных фрагментов антител для терапии.Основная причина этого — высокая задержка радиоактивно меченных фрагментов антител в почках, преимущественно при использовании радиометаллов в отличие от радиоактивного йода (41 , 42) . Поглощение почками фрагментов антител, меченных радиоактивными металлами, можно снизить предварительным введением лизина (43). , но даже этот метод не дает высокого соотношения опухоль / почка.

Хорошо продуманные подходы к предварительному таргетингу могут решить эти проблемы. В системах предварительного нацеливания радионуклид присоединяется к быстро очищающемуся агенту.Двумя наиболее часто используемыми агентами, о которых сообщалось на сегодняшний день, были биотин, радиоактивно меченный ¹¹¹ In / ⁹⁰ Y для подхода предварительного нацеливания стрептавидина, и пептид ди-DTPA-Tyr-Lys, радиоактивно меченный ¹³¹ I или ¹¹¹ In. для метода предварительного таргетинга bsAb. В каждом случае эти радиоактивно меченные соединения быстро выводятся из организма, в первую очередь, через почечную экскрецию. Почечная реадсорбция меньше, чем наблюдаемая для меченных радиометаллами Fab ‘-фрагментов, и, таким образом, соотношение опухоль / почка превышает 1 всего в течение нескольких часов после инъекции радиоактивно меченного биотина или пептида.Несмотря на быстрое выведение из крови и тела, различные исследователи показали, что с предварительным нацеливанием можно локализовать значительную фракцию радиоактивно меченного эффектора в опухоли. Действительно, интерес к использованию предварительного таргетинга для терапии значительно повысился после исследования Axworthy et al . (6) , который показал, что% ID / г радиоактивно меченного биотина, локализованного в опухоли, может быть равным таковому для непосредственно радиоактивно меченного антитела. Это открыло возможность того, что процедуры предварительного нацеливания могут не только давать лучшие отношения T / NT раньше, чем непосредственно радиоактивно меченные антитела, но и что количество радиоактивности, доставленной в опухоль, может быть таким же.Со временем исследователи показали улучшенную терапевтическую эффективность предварительного нацеливания по сравнению с прямым нацеливанием, и сообщалось о клинически многообещающих противоопухолевых эффектах при глиоме (44). и в НХЛ.4 Эти обнадеживающие результаты требуют дополнительного внимания к предварительному нацеливанию терапии.

Мы изучали новую систему предварительного нацеливания, которая включает использование m679, антитела, которое реагирует с гаптеном HSG (27) . Эта система, использующая химически конъюгированный bsAb, уже продемонстрировала превосходные свойства нацеливания с доказанной противоопухолевой активностью в доклинических испытаниях.Несмотря на то, что это очень полезно для доказательства принципа, если процедуры предварительного таргетинга должны перейти к клиническим применениям, необходимо учитывать дополнительные соображения относительно агента предварительного таргетинга. Во-первых, очень важна возможность воспроизводить большие количества bsAb. Во-вторых, доклинические испытания показали, что конструкция с двумя сайтами связывания для первичной опухоли-мишени улучшит захват и удержание bsAb на участке опухоли по сравнению с bsAb, имеющим только один сайт связывания для опухолевого антигена (29). .В-третьих, bsAb также должен обладать определенными фармакокинетическими свойствами, чтобы упростить процедуру, не требуя отдельного этапа очистки (29). . Получение bsAb с использованием технологии рекомбинантной ДНК удовлетворяет всем этим требованиям. Например, эти белки могут продуцироваться бактериями или дрожжами в крупных ферментерах, чтобы обеспечить большие количества bsAb. Среда для микробной ферментации стоит недорого по сравнению со средой для культивирования клеток млекопитающих. Даже при скромной урожайности 20 мг / литр от E.coli , производство значительно дешевле по сравнению с моноклональными антителами, продуцируемыми на гораздо более высоких уровнях в биореакторах с клетками млекопитающих. Для bsAb, полученного путем химической конъюгации, необходимо будет вырастить две разные клеточные линии для получения bsAb, тогда как одна клеточная линия будет производить желаемый рекомбинантный bsAb. Используя молекулярную инженерию, подходящий bsAb может быть сконструирован со связывающими и фармакокинетическими свойствами, которые равны или лучше, чем у химически связанного bsAb.Кроме того, рекомбинантный bsAb также можно сделать менее или неиммуногенным, приняв последовательность человеческого иммуноглобулина, такую ​​как BS1.5H.

Характеристика BS1.5 и BS1.5H включала определение чистоты с помощью SE-HPLC и SDS-PAGE, определение размера молекулы с помощью SE-HPLC, определение сродства связывания для CEA с помощью конкурентного ELISA, определение связывания сродство к HSG с помощью BIAcore и определение валентности связывания для CEA с помощью BIAcore. Эксперименты по связыванию BIAcore дали значения K _d для HSG, равные 2.5 и 1,55 нм для BS1,5 и hMN-14 × m679 соответственно. Эти значения по существу эквивалентны, поскольку разница находится в пределах экспериментального диапазона ошибок анализа. Исследования конкурентного связывания с помощью ELISA показали, что CEA-связывающие свойства BS1.5 и hMN-14 × m679 также были сходными. In vivo целевые исследования дополнительно подтвердили это, но BS1.5 предсказуемо имел более быстрый клиренс из крови и тканей, потому что он примерно в 2 раза меньше по размеру молекулы, чем hMN-14 × m679, который на самом деле очищался значительно быстрее у мышей, чем мог бы. можно ожидать для белка M _r ∼100000.Мы показали, что химерная природа bsAb, подобного hMN-14 × m679 (, т. Е. , состоит из одной гуманизированной части и одной части мыши), заставляет такой тип конструкции очищаться быстрее у мышей, чем конъюгат, состоящий полностью из мышиные Fab’-фрагменты (26) . Однако было показано, что у людей тот же тип химерной конструкции выводится из крови, как F (ab ‘) ₂ , как и следовало ожидать (17). . Конечно, можно ожидать, что меньшее биспецифическое диатело, такое как BS1.5, будет очищаться у людей быстрее, чем химический конъюгат с размером F (ab ‘) ₂ .Это дает BS1.5 фармакокинетическое преимущество и сокращает интервал, необходимый для введения пептида, потенциально избегая необходимости разработки стадии очистки. Предварительные исследования на мышах с опухолями показали, что BS1.5 вызывал подобное поглощение опухолью, но с более высокими отношениями T / NT, чем hMN-14 × m679, демонстрируя, как быстрый клиренс в сочетании с сопоставимой силой связывания для CEA и HSG для BS1.5 может быть используется как преимущество для предварительного таргетинга. Для всех тканей, кроме почек, получены соотношения для предварительного нацеливания с BS1.5 были> 5 раз больше, чем с hMN-14 × m679. Более высокая активность в почках объясняется почечным клиренсом радиоактивно меченных пептидов, как и предполагалось. Хотя соотношение опухоль / почка значительно ниже, чем для других органов, соотношение 3: 1 по-прежнему благоприятно для визуализации и терапевтических применений. Поскольку токсичность костного мозга часто определяет максимально переносимую дозу радиоактивно меченного антитела, превосходное соотношение опухоль / кровь при этой процедуре предварительного нацеливания должно позволить значительно повысить инъекционную активность и потенциально улучшить терапевтическую эффективность.Кроме того, меньший размер молекулы может облегчить проникновение и обеспечить более равномерное распределение антитела и пептида в опухоли.

Помимо снижения концентрации и удержания радиоактивности в крови и улучшения распределения радиоактивности в опухоли, другим способом повышения терапевтической эффективности является увеличение удерживания bsAb / пептида в опухоли. Для этого были разработаны два трехвалентных биспецифических белка, примером которых являются BS6 и BS8.Этот тип конструкции содержит одну HSG и две связывающие группы CEA и имеет размер на 20% меньше, чем химический конъюгат hMN-14 × m679. Связывание бивалентного CEA должно увеличивать удержание опухоли и, возможно, поглощение опухолью. Кроме того, белок такого размера ( M _r ∼81000) может оказаться идеальным для агента предварительного нацеливания, поскольку ожидается, что он сделает несколько проходов в опухоли, обеспечивая более высокое поглощение, но все же будет иметь благоприятный клиренс. ставки. К сожалению, уровни экспрессии BS6 или BS8 в E.coli были слишком низкими для изучения этих агентов на экспериментальных животных. Однако недавно нам удалось получить аналогичные трехвалентные биспецифические белки в дрожжах с гораздо более высокими выходами, и предварительные исследования биораспределения в условиях предварительного нацеливания очень обнадеживают (H. Karacay et al ., Неопубликованные результаты).

Конструкция BS1.5 или BS1.5H была основана на хорошо зарекомендовавшей себя технологии диател (32 , 45) . Использование пептидного линкера из пяти аминокислот (GGGGS) было предназначено для стимулирования преимущественного образования диател, а не других возможных структурных форм, таких как триатела (46). .Биохимический анализ ясно показал, что BS1.5 и BS1.5H почти исключительно образуют диатела.

BS6 и BS8 представляют собой новые структуры на основе scFv, образованные нековалентной ассоциацией трех пар V _H -V _K . В случае BS8 все три домена V _H содержатся в одном полипептиде, тогда как три домена V _K образуют вторую полипептидную цепь. BS6 имеет одну цепь, состоящую из двух V _H и одну V _K , и другую цепь, состоящую из двух V _K и одного V _H .В обоих случаях домены расположены специфическим антипараллельным образом для облегчения спаривания комплементарных доменов без стерических ограничений. Конструкция должна допускать образование только одного типа димера — подходящего гетеродимера — потому что не ожидается, что подобные домены будут ассоциироваться друг с другом. Домены V _H , которые не спарены с доменами V _L , нестабильны и нерастворимы из-за воздействия на гидрофобные поверхности, и в результате неспаренные полипептиды будут разлагаться и / или выпадать в осадок.BS6 и BS8 были охарактеризованы с помощью SE-HPLC и SDS-PAGE по чистоте, SE-HPLC по размеру молекулы и BIAcore по валентности связывания с CEA. После обширной очистки профили ВЭЖХ как BS6, так и BS8 показали главный пик с временем удерживания, соответствующим белку M _r ~ 80 000. Используя BIAcore, мы также определили, что BS6 и BS8 действительно обладают двумя функциональными сайтами связывания для CEA. Кроме того, тот факт, что BS6 и BS8 связывают HSG-связанные сенсорные чипы с высоким сродством, демонстрирует, что они содержат правильно спаренные 679 F _v .Трехвалентный биспецифический белок, который содержит два сайта связывания для опухоли-мишени и один сайт связывания для гаптена, имеет значительный потенциал для использования в различных приложениях, особенно в качестве агента предварительного нацеливания для AES.

В заключение, наш первоначальный опыт использования рекомбинантного bsAb, такого как BS1.5, в качестве агента предварительного нацеливания очень обнадеживает. Учитывая перспективы дополнительных улучшений как в дизайне, так и в производстве рекомбинантного bsAb, мы полагаем, что подход с предварительным нацеливанием на bsAb значительно повысит терапевтический индекс для опосредованной антителами доставки радионуклидов и, возможно, также цитотоксических препаратов.

Сноски

• №1 Представлено на «Девятой конференции по терапии рака с помощью антител и иммуноконъюгатов», 24–26 октября 2002 г., Принстон, штат Нью-Джерси. Частично поддержан грантом Министерства энергетики США DE-FG01-00NE22941 (на имя Р.М.С.).

• ↵2. Кому следует обращаться с запросами на перепечатку, по адресу IBC Pharmaceuticals, Inc., 300 American Road, Morris Plains, NJ 07950. Телефон: (973) 540-9595; Факс: (973) 605-8282; E-mail: kchang {at} иммуномедикс.com

• ↵3 Используемые сокращения: НХЛ, неходжкинская лимфома; AES, система повышения аффинности; bsAb, биспецифический связывающий белок, сконструированный химическим или рекомбинантным способом из двух различных моноклональных антител; СЕА, карциноэмбриональный антиген; ДТПА, диэтилентриаминпентауксусная кислота; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; HSG, гистамин сукцинилглицин; Ni-NTA, нитрилотриацетат в комплексе с ионом никеля (II); РАИТ, радиоиммунотерапия; RU, блок ответа; T / NT, опухоль в неопухоль.

• №4 Р. М. Шарки, Х. Каракай, Х. Ришель, У. Макбрайд, Э. А. Росси, К. Чанг, Д. Йелделл, Г. Л. Гриффитс, Х. Дж. Хансен и Д. М. Гольденберг. Оптимизация предварительного нацеливания биспецифических антител для использования в радиоиммунотерапии, отправлено для публикации.

Каталожные номера

1. ↵

   Гольденберг Д. М., ДеЛанд Ф., Ким Э., Беннетт С., Примус Ф. Дж., Ван Нагелл Дж. Р., младший, Эстес Н., ДеСимон П., Рейберн П. Использование радиоактивно меченных антител к карциноэмбриональному антигену для обнаружения и локализации различных видов рака с помощью внешнего фотосканирования. N. Engl. J. Med., 298 : 1384-1388, 1978.

2. ↵

   Гольденберг Д. М. Роль радиоактивно меченных антител в лечении неходжкинской лимфомы: наступление эры радиоиммунотерапии. Крит. Преподобный Онкол. Hematol., 39 : 195-201, 2001.

3. ↵

   Гольденберг Д.М. Таргетная терапия рака радиоактивно меченными антителами. J. Nucl. Med., 43 : 693-713, 2002.

4. ↵

   Чанг Ч., Шарки Р. М., Росси Э. А., Каракай Х., Макбрайд В., Хансен Х. Дж., Чатал Дж. Ф., Барбет Дж., Гольденберг Д. М. Молекулярные достижения в радиоиммунотерапии с предварительным нацеливанием биспецифических антител. Мол. Cancer Ther., 1 : 553-563, 2002.

5. ↵

   Le Doussal J-M., Martin M., Gautherot E., Delaage M., Barbet J. In vitro и in vivo нацеливание на радиоактивно меченые моновалентные и двухвалентные гаптены с конъюгатами моноклональных антител с двойной специфичностью: повышенная аффинность двухвалентного гаптена к связанным с клетками конъюгатам антител. J. Nucl. Med., 30 : 1358-1366, 1989.

6. ↵

   Эксуорси Д. Б., Фрицберг А. Р., Хиларидес М. Д., Маллет Р. В., Теодор Л. Дж., Густавсон Л. М., Су Ф. М., Beaumier P. L., Reno J. M. Доклиническая оценка конъюгата противоопухолевое моноклональное антитело / стрептавидин для предварительно направленной радиоиммунотерапии ⁹⁰ Y на модели ксенотрансплантата мыши. J. Immunother., 16 : 158 1994.

7. ↵

   Эксуорси Д. Б., Рино Дж. М., Хиларидес М. Д., Маллетт Р. В., Теодор Л. Дж., Густавсон Л. М., Су Ф., Хобсон Л. Дж., Бомье П. Л., Фрицберг А. Р. Лечение ксенотрансплантатов карциномы человека однократной дозой предварительно заданного иттрия-90 с незначительной токсичностью.Proc. Natl. Акад. Sci. США, 97 : 1802-1807, 2000.

8. ↵

   Press OW, Corcoran M., Subbiah K., Hamlin DK, Wilbur DS, Johnson T., Theodore L., Yau E., Mallett R., Meyer DL, Axworthy D. Сравнительная оценка традиционной и предварительно направленной радиоиммунотерапии Ксенотрансплантаты CD20-экспрессирующей лимфомы. Кровь, 98 : 2535-2543, 2001.

9. ↵

   Готеро Э., Bouhou J., LeDoussal J-M., Manetti C., Martin M., Rouvier E., Barbet J. Терапия ксенотрансплантатов карциномы толстой кишки с использованием биспецифических антител, меченных йодом-131 двухвалентным гаптеном. Cancer (Phila.), 80 (Suppl.) : 2618-2623, 1997.

10. ↵

    Gautherot E., Rouvier E., Daniel L., Loucif E., Bouhou J., Manetti C., Martin M., Le Doussal JM., Barbet J. Предварительно направленная радиоиммунотерапия колоректальных ксенотрансплантатов человека с биспецифическими антителами и ¹³¹ I-меченный двухвалентный гаптен.J. Nucl. Мед., 41 : 480-487, 2000.

11. ↵

    Брайтц Х. Б., Фишер Д. Р., Горис М. Л., Нокс С., Рэтлифф Б., Мурта А. Д., Вайден П. Л. Оценка поглощенной дозы излучения для ⁹⁰ Y-DOTA-биотин с предварительно нацеленным NR-LU-10 / стрептавидином. Рак Биотер. Radiopharm., 14 : 381-395, 1999.

12. ↵

    Нокс С. Дж., Горис М. Л., Темперо М., Вайден П. Л., Гентнер Л., Breitz H., Adams GP, Axworthy D., Gaffigan S., Bryan K., Fisher DR, Colcher D., Horak ID, Weiner LM Испытание фазы II иттрия-90-DOTA-биотина с предварительным нацеливанием NR-LU-10 антитела / стрептавидин у пациентов с метастатическим раком толстой кишки. Clin. Cancer Res., 6 : 406-414, 2000.

13. ↵

    Breitz HB, Weiden PL, Beaumier PL, Axworthy DB, Seiler C., Su FM, Graves S., Bryan K., Reno JM Клиническая оптимизация предварительно направленной радиоиммунотерапии конъюгатом антитело-стрептавидин и ⁹⁰ Y-DOTA-биотин .J. Nucl. Мед., 41 : 131-140, 2000.

14. ↵

    Vuillez J. P., Kraeber-Bodere F., Moro D., Bardies M., Douillard J. Y., Gautherot E., Rouvier E., Barbet J., Garban F., Moreau P., Chatal J-F. Радиоиммунотерапия мелкоклеточной карциномы легкого двухэтапным методом с использованием биспецифических антител против карциноэмбрионального антигена / диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) и гаптена йода-131 Di-DTPA: результаты испытаний фазы I / II. Clin.Cancer Res., 10 : 3259s-3267s, 1999.

15. ↵

    Kraeber-Bodere F., Bardet S., Hoefnagel CA, Vieira MR, Vuillez JP, Murat A., Ferreira TC, Bardies M., Ferrer L., Resche I., Gautherot E., Rouvier E., Barbet J ., Chatal JF. Радиоиммунотерапия медуллярного рака щитовидной железы с использованием биспецифических антител и бивалентного гаптена, меченного йодом 131: предварительные результаты клинических испытаний фазы I / II. Clin. Cancer Res., 10 : 3190s-3198s, 1999.

16. ↵

    Kraeber-Bodere F., Faivre-Chauvet A., Cerato E., Devillers A., Sharkey R.M., Chang K., Goldenberg D. M., Barbet J., Chatal J-F. Клиническая оптимизация двухэтапной радиоиммунотерапии (RAIT) с использованием ¹³¹ I-меченного биспецифического антитела против CEA / анти-гаптена и двухвалентного DTPA-гаптена, меченного ¹³¹ I, у пациентов с CEA-экспрессирующей опухолью. J. Nucl. Med., 42 (Suppl) : 123 2001.

17. ↵

    Барбет Дж., Kraeber-Bodere F., Faivre-Chauvet A., Ferre L., Rousseau C., Resche I., Vuillez J. P., Chang K., Sharkey R. M., Goldenberg D. M., Chatal J-F. Фармакокинетика и биораспределение биспецифических антител против CEA x против гаптена и ¹³¹ I-меченного гаптена у пациентов с предварительно направленной радиоиммунотерапией. J. Nucl. Med., 43 (Suppl.) : 159 2002.

18. ↵

    Леунг С.О., Гольденберг Д. М., Дион А. С., Пеллегрини М. К., Шевиц Дж., Ши Л.Б., Хансен Х. Дж. Создание и характеристика гуманизированного, интернализирующего, В-клеточного (CD22) -специфического антитела лейкемии / лимфомы, LL2. Мол. Immunol., 32 : 1413-1427, 1995.

19. ↵

    Sharkey RM, Juweid M., Shevitz J., Behr T., Dunn R., Swayne LC, Wong GY, Blumenthal RD, Griffiths GL, Siegel JA, Leung S., Hansen HJ, Goldenberg DM Оценка комплементарности- определение моноклонального антитела против карциноэмбрионального антигена с привитым участком (гуманизированным) в доклинических и клинических исследованиях.Cancer Res., 55 : 5935s-5945s, 1995.

20. ↵

    Кришнан И. С., Хансен Х. Дж., Лосман М. Дж., Голд Д., Гольденберг Д. М., Леунг С. О.. Химеризация Mu-9, специфического для толстой кишки антитела к антигену p, реагирующего с карциномами желудочно-кишечного тракта. Cancer (Phila.), 80 (Suppl.) : 2667-2674, 1997.

21. ↵

    Qu Z., Losman M. J., Eliassen K. C., Hansen H. J., Goldenberg D. M., Leung S.O.Гуманизация Immu31, антитела, специфичного к α-фетопротеину. Clin. Cancer Res., 5 : 3095s-3100s, 1999.

22. ↵

    Вайден П. Л., Брайтц Х. Б. Заранее направленная радиоиммунотерапия (PRIT) для лечения неходжкинской лимфомы (НХЛ). Крит. Преподобный Онкол. Hematol., 40 : 37-51, 2001.

23. ↵

    Press O. W., Eary J. F., Appelbaum F. R., Martin P. J., Badger C., Nelp W. B., Glenn S., Бутчко Г., Фишер Д. Р., Портер Б., Мэтьюз Д. С., Фишер Л. Д., Бернштейн И. Д. Терапия В-клеточной лимфомы с использованием аутологичных костномозговых антител. N. Engl. J. Med., 329 : 1219-1224, 1993.

24. ↵

    Press OW, Eary JF, Appelbaum FR, Martin PJ, Nelp WB, Glenn S., Fisher DR, Porter B., Matthews DC, Gooley T., Bernstein ID Phase II испытание антител 131I-B1 (анти-CD20) терапия с трансплантацией аутологичных стволовых клеток при рецидиве В-клеточных лимфом.Lancet, 346 : 336-340, 1995.

25. ↵

    Kaminski MS, Zelenetz AD, Press OW, Saleh M., Leonard J., Fehrenbacher L., Lister TA, Stagg RJ, Tidmarsh GF, Kroll S., Wahl RL, Knox SJ, Vose JM Основное исследование йода I 131 тозитумомаб для лечения невосприимчивых к химиотерапии низкосортных или трансформированных низкосортных В-клеточных неходжкинских лимфом. J. Clin. Онкол., 19 : 3918-3928, 2001.

26. ↵

    Карачай Х., McBride WJ, Griffiths GL, Sharkey RM, Barbet J., Hansen HJ, Goldenberg DM Экспериментальные исследования предварительного нацеливания рака с гуманизированной конструкцией мышиного анти- [In-DTPA] биспецифического антитела против CEA x и ^99m Tc- / ¹⁸⁸ Re-меченый пептид. Биоконъюг. Chem., 11 : 842-854, 2000.

27. ↵

    Морел А., Дармон М., Делаж М. Распознавание производных имидазола и гистамина моноклональными антителами.Мол. Immunol., 27 : 995-1000, 1990.

28. ↵

    Шарки Р. М., Макбрайд В. Дж., Каракай Х., Чанг К., Гриффитс Г. Л., Хансен Х. Дж., Гольденберг Д. М. Универсальная система предварительного нацеливания для обнаружения и терапии рака с использованием биспецифических антител. Cancer Res., 63 : 354-363, 2003.

29. ↵

    Каракай Х., Шарки Р. М., Макбрайд У. Дж., Гриффитс Г. Л., Ку З., Чанг К., Хансен Х.Дж., Гольденберг Д. М. Предварительное нацеливание на радиоиммунотерапию рака биспецифическими антителами: роль валентности биспецифических антител для антигена-мишени опухоли. Биоконъюг. Chem., 13 : 1054-1070, 2002.

30. ↵

    Шарки Р. М., Каракай Х., Макбрайд У. Дж., Чанг К., Хансен Х. Дж., Гольденберг Д. М. Терапевтические результаты с использованием новой системы предварительного нацеливания биспецифических антител для доставки Y-90. J. Nucl. Мед., 43 : 154P 2002.

31. ↵

    Хадсон П. Дж. Конструкции рекомбинантных антител в терапии рака. Curr. Opin. Immunol., 11 : 548-557, 1999.

32. ↵

    Хадсон П. Дж., Кортт А. А. Мультимеры scFv с высокой авидностью: диатела и триатела. J. Immunol. Методы, 231 : 177-189, 1999.

33. ↵

    Леунг С.О., Карачай Х., Лосман М. Дж., Гриффитс Г.Л., Гольденберг Д. М., Хансен Х. Дж. Бактериальная экспрессия слитого белка кемптида облегчает мечение ³² P фрагмента гуманизированного антитела против карциноэмбрионального антигена (hMN-14). Cancer Res., 55 : 5968s-5972s, 1995.

34. ↵

    Лосман М. Дж., Новик К. Э., Гольденберг Д. М., Монестиер М. Мимикрия эпитопа карциноэмбрионального антигена крысиным моноклональным антиидиотипическим антителом. Int. J. Cancer, 56, : 580-584, 1994.

35. ↵

    Гольденберг Д. М., Хансен Х. Дж. Карциноэмбриональный антиген, присутствующий в новообразованиях толстой кишки человека, серийно размножающихся у хомяков. Science (Вашингтон, округ Колумбия), 175 : 1117-1118, 1972.

36. ↵

    Уидок К. С., Шарки Р. М., Варга Д. К., Гольденберг Д. М. Оценка системы дистанционного радиойодирования для радиоиммунотерапии. J. Nucl. Med., 31 : 508-511, 1990.

37. ↵

    Пей X.Y., Холлигер П., Мурзин А. Г., Уильямс Р. Л. Кристаллическая структура с разрешением 2,0 Å фрагмента тримерного антитела с парами непохожих доменов VH-VL показывает перестройку VH CDR3. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 94 : 9637-9642, 1997.

38. ↵

    Шарки Р. М., Блюменталь Р. Д., Хансен Х. Дж., Гольденберг Д. М. Биологические аспекты радиоиммунотерапии. Cancer Res., 50 : 964s-969s, 1990.

39. ↵

    Гольденберг Д.М., Ларсон С. М. Радиоиммунодетекция в выявлении рака. J. Nucl. Med., 33 : 803-814, 1992.

40. ↵

    Бер Т. М., Блюменталь Р. Д., Мемтсудис С., Шарки Р. М., Грац С., Беккер В., Гольденберг Д. М. Лечение метастатического рака толстой кишки у мышей с помощью радиоактивно меченных фрагментов моноклональных антител. Clin. Cancer Res., 6 : 4900-4907, 2000.

41. ↵

    Шарки Р.М., Мотта-Хеннесси С., Павлик Д., Сигел Дж. А., Гольденберг Д. М. Оценка биораспределения и дозы облучения для меченных иттрием и йодом моноклональных антител IgG и фрагментов у голых мышей, несущих ксенотрансплантаты опухоли толстой кишки человека. Cancer Res., 50 : 2330-2336, 1990.

42. ↵

    Бер Т. М., Гольденберг Д. М., Беккер В. Снижение захвата почками радиоактивно меченных фрагментов антител и пептидов для диагностики и терапии: текущее состояние, перспективы на будущее и ограничения.Евро. J. Nucl. Med., 25 : 201-212, 1998.

43. ↵

    Бер Т. М., Шарки Р. М., Джувейд М. Э., Блюменталь Р. Д., Данн Р. М., Баир Х. Дж., Гриффитс Г. Л., Вольф Ф. Г., Беккер В. С., Гольденберг Д. М. Снижение захвата почками радиоактивно меченных фрагментов моноклональных антител катионными аминокислотами и их производными. Cancer Res., 55 : 3825-3834, 1995.

44. ↵

    Грана К., Chinol M., Robertson C., Mazzetta C., Bartolomei M., DeCicco C., Fiorenza M., Gatti M., Caliceti P., Paganelli G. Предварительная адъювантная радиоиммунотерапия иттрием-90-биотином у пациентов со злокачественной глиомой: пилотное исследование. Br. J. Cancer, 86 : 207-212, 2002.

45. ↵

    Холлигер П., Просперо Т., Винтер Г. «Диабеты»: небольшие фрагменты двухвалентных и биспецифических антител. Proc. Natl. Акад. Sci. США, 90 : 6444-6448, 1993.

46. ↵

    Росси Э. А., Чанг С. Х., Каракай Х., Зенг Л., Шарки Р. М., Гольденберг Д. М. Нацеливание на опухоль с помощью гуманизированных диател против СЕА, триател и тетрател. Proc. Являюсь. Доц. Cancer Res., 43 : 911 2002.

Новый тип галогенной связи с участием поливалентного астата: исследование ab initio

Теоретические исследования димеров, образованных CO с галогенидами многовалентного астата в качестве кислотного центра Льюиса, проводятся для изучения типичных характеристик супервалентных галогеновых связей.Расчеты на уровне MP2 / aug-cc-pVTZ показывают, что множественные нуклеофильные сайты мономеров поливалентных галогенидов могут способствовать образованию различных типов галогеновых связей, среди которых наиболее стабильными являются комплексы связи At – галоген с поливалентным астатином в качестве Льюиса. кислотный центр, за ним следуют димеры π – галогеновой связи, а самыми слабыми из них являются связи X – галоген. По сравнению с многовалентными Cl-, Br- и I-центрами, At, как самый тяжелый галоген, проявляет самую высокую способность отдавать галогеновые связи.Мы обнаружили, что электростатический член и дисперсионный член играют важную роль в общей энергии притягивающего взаимодействия, а наименьший член притяжения для всех комплексов — это поляризационный член (Δ E _pol ). Более того, анализируемые здесь трех- и пятивалентные галогениды обладают очень «гибкой» таутомерией, в которой превращение происходит во время образования димеров. Здесь также используются теория AIM и анализ NBO.

У вас есть доступ к этой статье

Как изменить дизайн вакцин против COVID, чтобы они защищали от вариантов

человек ждут вакцины от коронавируса в больнице в Глазго, Великобритания.Предоставлено: Джефф Дж. Митчелл / Гетти

По мере роста доказательств того, что новые варианты коронавируса SARS-CoV-2 могут уклоняться от иммунитета, вызванного вакцинами или предыдущими инфекциями, ученые изучают идею изменения конструкции вакцин, которые в настоящее время внедряются во всем мире.

Исследователи все еще обсуждают, могут ли новые варианты снизить эффективность этих вакцин против COVID-19 первого поколения. Но некоторые разработчики вакцин продвигаются вперед с планами обновить свои прививки, чтобы они могли лучше нацеливаться на появляющиеся варианты, такие как те, которые были выявлены в Южной Африке и Бразилии.Эти линии несут мутации, которые, кажется, ослабляют действие антител, критически важных для отражения инфекции. Исследователи также рассматривают возможность того, что вакцины против коронавируса, возможно, придется периодически обновлять, как и против гриппа.

Лучший и самый незамедлительный способ борьбы с угрозой появления новых вариантов — это, вероятно, быстро вакцинировать как можно больше людей с помощью текущих прививок, — говорит Мани Фороохар, аналитик по биотехнологиям инвестиционного банка SVB Leerink в Бостоне, штат Массачусетс: «Мы нужно заполучить вакцины и задушить этот вирус, прежде чем он снова взорвется перед нами.

Но Фороохар и другие ожидают, что в будущем появится множество новых вакцин для борьбы с вариантами COVID-19. Nature исследует открытые вопросы об обновлении мировых вакцин против коронавируса.

Нужны ли нам обновленные вакцины против COVID-19?

«Я думаю, что это начинает выглядеть так», — говорит Канта Суббарао, вирусолог из Института инфекций и иммунитета Питера Доэрти в Мельбурне, Австралия.

Лаборатории по всему миру стремятся понять угрозу, которую новые варианты коронавируса представляют для вакцин.Но первые выводы из этих исследований неоднозначны и неполны. Вариант, выявленный в конце 2020 года в Южной Африке, под названием 501Y.V2 (также известный как вариант B.1.351), является одним из наиболее тревожных. Лабораторные анализы показали, что он несет мутации, которые подрывают эффективность инактивирующих вирус «нейтрализующих антител», которые были созданы людьми, получившими РНК-вакцины Pfizer или Moderna.

Неясно, достаточно ли этих изменений для снижения эффективности этих вакцин, говорит Суббарао.«Это вопрос на миллион долларов, потому что мы не знаем, сколько антител вам нужно». Другие иммунные ответы, которые вызывают вакцины, могут помочь защитить от эффектов вариантов.

Но 28 января биотехнологическая компания Novavax опубликовала данные клинических испытаний, показывающие, что ее экспериментальная вакцина, разработанная для борьбы с исходным вирусом, была примерно на 85% эффективна против варианта, идентифицированного в Соединенном Королевстве, но менее чем на 50% против 501Y. .V2. Это падение вызывает беспокойство, говорят исследователи, потому что указывает на то, что 501Y.V2 и другие подобные ему варианты могут вызвать значительное снижение эффективности вакцин.

«Я думаю, что вакцины неизбежно сохранят максимальную эффективность, их нужно будет обновить. Вопрос только в том, как часто и когда », — говорит Пол Биениас, вирусолог из Университета Рокфеллера в Нью-Йорке, который был одним из руководителей одного из исследований нейтрализующих антител.

Как мы должны решить, когда обновлять вакцины?

Ученые, чиновники здравоохранения и производители вакцин начинают это выяснять.Исследователи только начинают понимать, как разные мутации влияют на реакцию вакцины и как эволюционные силы могут вызывать распространение мутаций. «Я бы точно не стал обновлять их сейчас», — говорит Бениаш.

Одной из моделей, которой могут следовать обновления вакцины COVID-19, являются вакцины от сезонного гриппа, — говорит Суббарао, руководитель Центра сотрудничества Всемирной организации здравоохранения по справочным материалам и исследованиям гриппа в Мельбурне. Центры, в том числе и ее, отслеживают появляющиеся штаммы гриппа на предмет генетических изменений, которые могут повлиять на эффективность вакцин.Исследователи используют исследования с использованием антител хорька и человека, чтобы определить, может ли новый штамм гриппа избежать вакцинации предыдущего сезона и, следовательно, потребуется обновление. Эти обзоры проводятся ежегодно для каждого сезона гриппа в каждом полушарии, и изменения вносятся только тогда, когда широко распространен штамм, уклоняющийся от вакцинации, говорит Суббарао. «Если она будет локализована в одном регионе, в одной стране, мы не будем менять вакцину для всего полушария».

Как правило, порог обновления вакцин против гриппа аналогичен по величине порогу изменений в ответах нейтрализующих антител, которые исследователи связывают с 501Y.Вариант V2. Но пока неясно, как эти сдвиги — и географическое распределение различных вариантов и мутаций — повлияют на обновления вакцины COVID-19. «Эти обсуждения только начинаются», — говорит Суббарао. «Мы не можем гнаться за каждым появляющимся вариантом».

Как будут обновляться вакцины?

Это еще один открытый вопрос. Некоторые вакцины против COVID-19, в том числе основные вакцины, произведенные Moderna, Pfizer и AstraZeneca, инструктируют клетки производить спайковый белок вируса — ключевую мишень иммунной системы для коронавирусов.Варианты, включая 501Y.V2, несут спайковые мутации, которые изменяют целевые области с помощью нейтрализующих антител.

Одна из возможностей состоит в том, чтобы заменить старые версии вакцины спайк-белка, в основном основанные на вирусе, который был впервые идентифицирован в Ухане, Китай, на обновленную молекулу, которая имеет специфические аминокислотные изменения, препятствующие ответу антител. Но сначала исследователям необходимо определить, имеют ли такие изменения побочные эффекты, которые изменяют реакцию иммунной системы на вакцину.Другая возможность — включить в один укол как новые, так и старые формы белка-шипа — ученые называют это мультивалентной вакциной.

Moderna начала работу по обновлению своей мРНК-вакцины для соответствия спайковым мутациям в 501Y.V2. Биотехнологическая компания, базирующаяся в Кембридже, штат Массачусетс, заявляет, что также намеревается протестировать эффективность третьей дозы своей оригинальной вакцины против коронавируса и изучает возможность создания поливалентной вакцины, сказал главный научный сотрудник Moderna Тал Закс в своем интервью. 25 января звонок с инвесторами.Но прежде чем выбрать какой-либо путь, исследователи должны будут изучить, как животные и, возможно, люди реагируют на любое потенциальное обновление вакцины, говорит Суббарао. «Это не будет так просто, как [изменить] аминокислотный сайт и сказать:« Хорошо, мы ». понятно’.»

Вирус SARS-CoV-2 приобрел несколько мутаций, которые меняют его поведение Фото: NIAID-RML / NIH / Flickr

Как будут проходить испытания и одобрение вакцин?

Разработчики вакцин протестировали имеющиеся в настоящее время вакцины против COVID-19 в испытаниях фазы III с участием десятков тысяч участников, прежде чем регулирующие органы разрешили использование препаратов.Но такое тестирование обновленной вакцины будет медленным и трудным сейчас, когда вакцины первого поколения внедряются во всем мире, говорит иммунолог Дрю Вайсман из Пенсильванского университета в Филадельфии: «Я не могу представить, как они могли провести этап III испытание варианта ».

Неясно, сколько клинических данных потребуется для утверждения обновления вакцины COVID-19. Новые вакцины против сезонного гриппа обычно не требуют новых испытаний. Но регулирующие органы не имеют уверенности в многолетнем опыте и клинических данных с вакцинами COVID-19.«Они могут сказать:« Это новая вакцина, давайте проведем пару клинических испытаний », — говорит Вайсман.

Размер и продолжительность этих испытаний могут зависеть от того, смогут ли исследователи найти «корреляты защиты»: измеримые характеристики иммунного ответа, такие как определенный уровень нейтрализующих антител, которые могут служить маркером защиты от COVID-19. С такими маркерами исследователям не нужно было бы ждать, пока участники испытаний заразятся коронавирусом, чтобы узнать, работают ли вакцины — они могли бы просто измерять иммунный ответ после каждой дозы.

Нет никакой гарантии, что появится надежный коррелят, говорит Пол Оффит, исследователь вакцин из Детской больницы Филадельфии в Пенсильвании. Но даже без точной корреляции исследователи все же смогут продемонстрировать, что их новая вакцина производит уровни антител, аналогичные вакцинам первого поколения. Moderna заявила, что ожидает, что сможет положиться на клинические испытания с участием сотен, а не тысяч участников, чтобы продвигать свою вакцину против 501Y.Вариант V2. Foroohar ожидает, что компании потребуется около пяти месяцев, чтобы перейти от производства новой вакцины до передачи данных ее испытаний регулирующим органам.

Исследователи еще не знают, как человек, полностью вакцинированный вакциной COVID-19 первого поколения, отреагирует на новую вакцину против нового варианта. Иммунологи давно заметили, что люди склонны вызывать более устойчивые иммунные ответы на первый вариант патогена, с которым они сталкиваются, чем на последующие варианты.Этот феномен может означать, что обновленные вакцины могут вызывать более приглушенный иммунный ответ, чем реакция на первую вакцину. «Есть опасения, что поддержка кого-либо с помощью варианта не приведет к новому ответу на этот вариант», — говорит Вайсман. «Это только усилит старый отклик».

Но Вайсман утверждает, что есть некоторые свидетельства того, что вакцины с РНК не могут стать жертвой этой тенденции. По неясным причинам некоторые РНК-вакцины вызывают неожиданно сложные иммунные ответы, давая антитела, нацеленные на области вирусных белков, которые часто не обнаруживаются в ответах на другие виды вакцин.Это может означать, что вакцины с РНК также смогут лучше воздействовать на изменения, присутствующие в варианте, говорит Вайсман.

И Оффит отмечает, что вариант-специфический ответ может не потребоваться: даже если обновленная вакцина в основном усиливает ответ на более раннюю вакцину против коронавируса, этого все равно может быть достаточно, чтобы парировать варианты, говорит он.

Чем занимаются производители вакцин?

Как и Moderna, другие производители вакцин против коронавируса заявили, что они изучают возможность обновления своих вакцин.Среди них компания Johnson & Johnson из Нью-Брансуика, штат Нью-Джерси, которая разрабатывает однократную вакцину против коронавируса.

Некоторые начинающие производители вакцин с самого начала заметили угрозу, которую могут представлять варианты побега. Команда Gritstone Oncology решила сосредоточиться на этой потенциальной проблеме, разработав вакцину, которая нацелена на несколько участков на нескольких вирусных белках, в отличие от уколов первого поколения, нацеленных только на спайковый белок, — говорит Эндрю Аллен, президент компании в Эмеривилле. Калифорния.Есть надежда, что вакцина, клинические испытания которой должны скоро начаться, затруднит уклонение вируса от иммунитета, потому что для этого потребуются многие генетические изменения. «Вы можете либо сыграть в игру« Бей крота »и преследовать варианты, либо попытаться опередить их», — говорит Аллен.

Поскольку обновление конструкции существующих вакцин относительно просто, новая РНК-вакцина может быть разработана и изготовлена ​​для клинических испытаний в течение шести недель, считает Вайсман.

Но это только начало. «Сложно производить вакцину массово. Будет сложно начать все сначала », — говорит Оффит.

Некоторые исследователи ожидают, что периодические обновления вакцин против коронавируса, как и в случае с гриппом, станут образом жизни. «В этом нет ничего необычного, — говорит Стэнли Плоткин, консультант, консультирующий компании по вакцинам. Но это может означать, что беспокойство по поводу цепочек поставок и логистики будет продолжаться еще какое-то время.

Новые критерии для мероморфных многозначных альфа-выпуклых функций

Целью данной статьи является получение достаточного условия для класса мероморфных -валентных альфа-выпуклых функций порядка и последующее изучение отображение свойств вновь определенных интегральных операторов.Многие известные результаты явились частным следствием нашей работы.

1. Введение

Обозначим через класс мероморфных функций, нормированных на которые являются аналитическими и -валентными в проколотом единичном диске. В частности,, и. Для которых реально с« и« мы обозначаем через, и подклассы, состоящие из всех мероморфных -валентных функций вида (1), которые определяются, соответственно, Делая, в (2), мы получаем хорошо известные подклассы, состоящие из мероморфно-валентных функций, которые являются звездообразными, выпуклыми и альфа-выпуклыми по порядку соответственно.Для получения подробной информации о классах, определенных в (2), и связанных темах, мы отсылаем исследователя к работам Ауфа и Хоссена [1], Ауфа и Шриваставы [2], Али и Равичандрана [3], Гояла и Праджапата [4], Джоши и Шривастава [5], Лю и Шривастава [6], Райна и Шривастава [7], Сюй и Ян [8] и Ова и др. [9].

For, Wang et al. [10], а также Нехари и Нетаньяху [11] ввели и изучили подкласс, состоящий из функций, удовлетворяющих Теперь мы расширили эту концепцию, чтобы определить подкласс, состоящий из функций вида (1), удовлетворяющих Для и в (4) получаем классы и соответственно, изученные Арифом [12]; также см. [13, 14].

Интегральные операторы для различных классов аналитических, однолистных и многовалентных функций в открытом единичном круге изучаются разными авторами; см. [15–21]. Теперь определим следующий общий интегральный оператор мероморфно-валентных функций: При мы получаем интегральный оператор, недавно изученный в [22, 23], и далее при получаем интегральный оператор, введенный и изученный Мохаммедом и Дарусом [24].

Достаточные условия изучались разными авторами для разных подклассов аналитических и многовалентных функций; некоторые работы по теме см. в [25–27].Цель данной статьи — получить достаточные условия для класса, а затем изучить свойства отображения интегрального оператора (5). Мы также рассматриваем некоторые частные случаи наших результатов, которые приводят к различным интересным следствиям и релевантности некоторых из этих результатов другим известным результатам, которые также упоминаются.

На протяжении всего обсуждения, если не указано иное, мы будем предполагать, что это реально с,, ,,, для,,, и

Для получения основных результатов нам потребуются следующие леммы.

Лемма 1 (см. [27]). Если с и удовлетворяет условию потом

Лемма 2 (см. [28]). Пусть удовлетворяет следующему условию:
Если функция аналитическая в и потом

2. Критерии достаточности для класса

В этом разделе мы устанавливаем новые критерии достаточности для подкласса.

Теорема 3. Если удовлетворяет тогда, где дается формулой (6).

Доказательство. Зададим функцию по формуле для . Тогда (13) ясно показывает это.
Логарифмическое дифференцирование (13) дает что далее подразумевает Таким образом, используя (12), получаем Следовательно, по лемме 1 имеем.
Из (14) можно записать Поскольку это означает, что.Следовательно, мы получаем или И поэтому .
Взяв и в теореме 3, получаем следствия 4 и 5 соответственно, доказанные Арифом [12].

Следствие 4. Если удовлетворяет потом .

Следствие 5. Если удовлетворяет потом .

Примечания . Отметим, что простым вычислением (13) дает Взяв подходящую мероморфную звездообразную функцию в качестве в (22), такую ​​как, которая удовлетворяет неравенству леммы 1, мы можем заключить, что функция из (22) является подклассом мероморфной функции.

3. Некоторые свойства интегрального оператора

В этом разделе мы обсудим некоторые свойства отображения интегрального оператора.

Теорема 6. Для, пусть и удовлетворяет (20). Если тогда с, и дается формулой (5).

Доказательство. Из (5) получаем Разделив обе стороны на, получим Снова логарифмически дифференцируя, имеем Теперь простыми вычислениями получаем или, что то же самое, у нас есть Принимая действительное участие с обеих сторон, получаем откуда далее следует, что Позволять Ясно, что у нас есть Тогда, используя (23) и теорему 3 при, получаем Поэтому с.
Делая в теореме 6, имеем следующее.

Следствие 7. Для, пусть и удовлетворяют (20). Если затем с.

Теорема 8. Для, пусть. Если потом, где с.

Доказательство. Из (26) получаем Позволять такое, что является аналитическим в с. Тогда (36) можно записать как Принимая реальное участие с обеих сторон, мы где мы использовали (35) и предположение, что.Положим Тогда для такого, что мы имеем Таким образом, используя лемму 2, заключаем, что, что равносильно Это, .

Благодарность

Представленная здесь работа была частично поддержана LRGS / TD / 2011 / UKM / ICT / 03/02.

Полиэлектролиты в поливалентных ионных средах: новая физика и новые материалы | Химическая инженерия

Полиэлектролиты в поливалентных ионных средах: новая физика и новые материалы

Докладчик: Мэтью Тиррелл, директор и декан Притцкеровской школы молекулярной инженерии Чикагского университета

Abstract: Мультивалентные взаимодействия в системах полиэлектролитов могут проявлять драматические, немонотонные эффекты, например, переключение сил с отталкивания на притяжение, а в некоторых случаях — снова на отталкивающее.Мы изучали эти модели поведения с помощью аппарата поверхностных сил (SFA) и электрохимических методов, таких как циклическая вольтамперометрия, которая позволяет количественно определять количество многовалентных ионов, находящихся в тонких слоях заряженных полимеров. При фиксированной ионной силе все они вызывают сильную усадку и конденсацию щеток из полистиролсульфоната в узком диапазоне соотношения многовалентных и одновалентных ионов. Когда многовалентный ион представляет собой противоположно заряженный полимер, могут образовываться новые жидкие фазы.Мы прояснили количественные аспекты фазовой диаграммы для упрощенной полиэлектролитной сложной системы. Заряженные блоки в сополимерах приводят к материалам с новыми типами упорядоченных фаз. Будет обсуждаться влияние этих поливалентных взаимодействий на надмолекулярную и биомолекулярную сборку. Есть много возможностей для создания новых материалов на основе электростатической сборки с использованием многовалентных взаимодействий

Биография докладчика: Мэтью Тиррелл занимается исследованиями границ раздела полимеров, динамики, поведения жидкой фазы и наномедицины.Он особенно известен своей работой по полимерным щеткам, измерению поверхностной силы, пептидным амфифилам и поведению фаз полиэлектролитного комплекса. В 2011 году Мэтью Тиррелл был назначен директором-основателем Притцкера и деканом факультета Института молекулярной инженерии и основал первую инженерную программу Чикагского университета, которую он продолжает курировать (ныне Притцкеровская школа молекулярной инженерии). Профессор Тиррелл одновременно занимал должности заместителя директора лаборатории по науке (сентябрь 2015 г. — апрель 2018 г.) и главного научного сотрудника (январь 2017 г. — март 2018 г.) в Аргоннской национальной лаборатории.Непосредственно перед тем, как поступить в Чикагский университет, он был профессором Арнольда и Барбары Сильверман и заведующим кафедрой биоинженерии в Калифорнийском университете в Беркли, с дополнительными назначениями в области химического машиностроения, материаловедения и инженерии, а также должности научного сотрудника в Институте Национальная лаборатория Лоуренса Беркли. Д-р Тиррелл проработал десять лет в должности декана инженерного факультета Калифорнийского университета в Санта-Барбаре 30 июня 2009 года. С 1977 по 1999 год он работал на факультете химической инженерии и материаловедения в Университете Миннесоты, где занимал должность заведующий отделом с 1994 по 1999 гг.Тиррелл получил степень бакалавра наук. в области химической инженерии в Северо-Западном университете в 1973 г. и получил степень доктора философии. в 1977 году получил степень в области науки о полимерах Массачусетского университета. Он является соавтором около 400 статей и одной книги, под его руководством около 100 кандидатов наук. студентов и 50 докторантов. Профессор Тиррелл является членом Национальной инженерной академии, Национальной академии наук, Американской академии искусств и наук и Индийской национальной инженерной академии, а также членом Американского института инженеров-медиков и биологических инженеров (AAAS). и Американское физическое общество