АВТО БЛОГ YAMAHA-VOLGA.RU

• Моя библиотека

PostgreSQL: Документация: 9.5: Конфигурация WAL

Существует несколько параметров конфигурации, связанных с WAL, которые влияют на производительность базы данных. В этом разделе объясняется их использование. Обратитесь к Главе 18 за общей информацией о настройке параметров конфигурации сервера.

Контрольные точки — это точки в последовательности транзакций, в которых гарантируется, что файлы данных кучи и индекса были обновлены всей информацией, записанной до этой контрольной точки. Во время контрольной точки все грязные страницы данных сбрасываются на диск, а в файл журнала записывается специальная запись контрольной точки.(Записи изменений ранее были сброшены в файлы WAL.) В случае сбоя процедура восстановления после сбоя просматривает последнюю запись контрольной точки, чтобы определить точку в журнале (известную как запись повтора), с которой она должна начать Операция ПОВТОР. Любые изменения, внесенные в файлы данных до этого момента, гарантированно будут уже на диске. Следовательно, после контрольной точки сегменты журнала, предшествующие сегменту, содержащему повторную запись, больше не нужны и могут быть переработаны или удалены. (Когда выполняется архивирование WAL, сегменты журнала должны быть заархивированы перед повторным использованием или удалением.)

Требование контрольной точки сброса всех грязных страниц данных на диск может вызвать значительную нагрузку ввода-вывода. По этой причине активность контрольной точки регулируется таким образом, что ввод-вывод начинается при запуске контрольной точки и завершается до того, как должна начаться следующая контрольная точка; это сводит к минимуму снижение производительности во время контрольных точек.

Серверный процесс контрольной точки периодически автоматически выполняет контрольную точку. Контрольная точка запускается каждые секунды checkpoint_timeout или если max_wal_size вот-вот будет превышен, в зависимости от того, что наступит раньше.Настройки по умолчанию — 5 минут и 1 ГБ соответственно. Если после предыдущей контрольной точки не было записано ни одного WAL, новые контрольные точки будут пропущены, даже если время ожидания checkpoint_timeout истекло. (Если используется архивация WAL и вы хотите установить более низкий предел частоты архивирования файлов, чтобы ограничить возможную потерю данных, вам следует настроить параметр archive_timeout, а не параметры контрольной точки.) Также можно принудительно установить контрольную точку. с помощью команды SQL CHECKPOINT.

Уменьшение checkpoint_timeout и/или max_wal_size приводит к более частому появлению контрольных точек.Это позволяет быстрее восстановиться после сбоя, поскольку потребуется переделывать меньше работы. Однако необходимо сбалансировать это с увеличением затрат на более частую очистку грязных страниц данных. Если установлено значение full_page_writes (по умолчанию), необходимо учитывать еще один фактор. Чтобы обеспечить согласованность страниц данных, первое изменение страницы данных после каждой контрольной точки приводит к регистрации всего содержимого страницы. В этом случае меньший интервал между контрольными точками увеличивает объем вывода в журнал WAL, что частично сводит на нет цель использования меньшего интервала и в любом случае приводит к большему дисковому вводу-выводу.

Контрольные точки довольно затратны, во-первых, потому что они требуют записи всех грязных в данный момент буферов, а во-вторых, потому что они приводят к дополнительному последующему трафику WAL, как обсуждалось выше. Поэтому разумно установить достаточно высокие параметры контрольных точек, чтобы контрольные точки не случались слишком часто. В качестве простой проверки работоспособности ваших параметров контрольных точек вы можете установить параметр checkpoint_warning. Если контрольные точки расположены ближе друг к другу, чем количество секунд checkpoint_warning, в журнал сервера будет выведено сообщение с рекомендацией увеличить max_wal_size.Периодическое появление такого сообщения не является поводом для беспокойства, но если оно появляется часто, то следует увеличить параметры контроля КПП. Массовые операции, такие как большие передачи COPY, могут вызвать появление ряда таких предупреждений, если вы не установили достаточно высокое значение max_wal_size.

Чтобы избежать перегрузки системы ввода-вывода всплесками операций записи страниц, запись грязных буферов во время контрольной точки распределяется на определенный период времени. Этот период контролируется checkpoint_completion_target, который задается как часть интервала контрольной точки.Скорость ввода-вывода настраивается таким образом, чтобы контрольная точка завершалась по истечении заданной доли секунд checkpoint_timeout или до превышения max_wal_size, в зависимости от того, что наступит раньше. При значении по умолчанию 0,5 можно ожидать, что PostgreSQL завершит каждую контрольную точку примерно в два раза быстрее, чем запустится следующая контрольная точка. В системе, которая очень близка к максимальной пропускной способности ввода-вывода при нормальной работе, вы можете увеличить значение checkpoint_completion_target, чтобы уменьшить нагрузку ввода-вывода от контрольных точек.Недостаток этого заключается в том, что продление контрольных точек влияет на время восстановления, поскольку необходимо будет хранить больше сегментов WAL для возможного использования при восстановлении. Хотя для checkpoint_completion_target может быть задано значение 1,0, лучше оставить его меньше (максимум 0,9), поскольку контрольные точки включают в себя некоторые другие действия, помимо записи грязных буферов. Значение 1.0, скорее всего, приведет к тому, что контрольные точки не будут завершены вовремя, что приведет к потере производительности из-за неожиданного изменения количества необходимых сегментов WAL.

Количество файлов сегментов WAL в каталоге pg_xlog зависит от min_wal_size, max_wal_size и объема WAL, сгенерированного в предыдущих циклах контрольных точек. Когда старые файлы сегментов журнала больше не нужны, они удаляются или перерабатываются (то есть переименовываются, чтобы стать будущими сегментами в пронумерованной последовательности). Если из-за кратковременного пика скорости вывода журнала превышен max_wal_size, ненужные файлы сегментов будут удалены до тех пор, пока система не вернется к этому пределу. Ниже этого предела система перерабатывает достаточно файлов WAL, чтобы покрыть расчетную потребность до следующей контрольной точки, а остальные удаляет.Оценка основана на скользящем среднем количестве файлов WAL, использованных в предыдущих циклах контрольных точек. Скользящее среднее немедленно увеличивается, если фактическое использование превышает оценку, поэтому оно в некоторой степени учитывает пиковое использование, а не среднее использование. min_wal_size устанавливает минимальное количество файлов WAL, перерабатываемых для будущего использования; такое большое количество WAL всегда перерабатывается для использования в будущем, даже если система простаивает, а оценка использования WAL предполагает, что требуется небольшое количество WAL.

Независимо от max_wal_size, wal_keep_segments + 1 постоянно сохраняются последние файлы WAL.Кроме того, если используется архивация WAL, старые сегменты нельзя удалить или переработать, пока они не будут заархивированы. Если архивирование WAL не успевает за темпом создания WAL или если команда archive_command неоднократно дает сбой, старые файлы WAL будут накапливаться в pg_xlog до тех пор, пока ситуация не будет решена. Медленный или неисправный резервный сервер, использующий слот репликации, будет иметь тот же эффект (см. Раздел 25.2.6).

В режиме восстановления архива или в режиме ожидания сервер периодически выполняет точки перезапуска , которые аналогичны контрольным точкам при нормальной работе: сервер записывает все свое состояние на диск, обновляет файл pg_control, чтобы указать, что уже обработанные данные WAL не нужно снова сканируется, а затем повторно использует все старые файлы сегментов журнала в каталоге pg_xlog.Точки перезапуска не могут выполняться чаще, чем контрольные точки в мастере, потому что точки перезапуска могут выполняться только в записях контрольных точек. Точка перезапуска запускается при достижении записи контрольной точки, если с момента последней точки перезапуска прошло не менее checkpoint_timeout секунд или если размер WAL вот-вот превысит max_wal_size. Однако из-за ограничений на то, когда может быть выполнена точка перезапуска, max_wal_size часто превышается во время восстановления на значение WAL, равное одному циклу контрольной точки.(max_wal_size в любом случае никогда не является жестким ограничением, поэтому вы всегда должны оставлять достаточно места, чтобы избежать нехватки места на диске.)

Существуют две часто используемые внутренние функции WAL: XLogInsertRecord и XLogFlush . XLogInsertRecord используется для помещения новой записи в буферы WAL в разделяемой памяти. Если для новой записи нет места, XLogInsertRecord придется записать (переместить в кеш ядра) несколько заполненных буферов WAL. Это нежелательно, так как XLogInsertRecord используется при каждом низкоуровневом изменении базы данных (например, при вставке строк) в то время, когда на затронутых страницах данных удерживается монопольная блокировка, поэтому операция должна быть максимально быстрой.Что еще хуже, запись буферов WAL также может привести к созданию нового сегмента журнала, что занимает еще больше времени. Обычно буферы WAL следует записывать и сбрасывать с помощью запроса XLogFlush , который выполняется, по большей части, во время фиксации транзакции, чтобы гарантировать, что записи транзакций будут сброшены в постоянное хранилище. В системах с большим количеством выходных данных журнала запросы XLogFlush могут возникать недостаточно часто, чтобы предотвратить запись XLogInsertRecord . В таких системах следует увеличить количество буферов WAL, изменив параметр wal_buffers.Если установлено значение full_page_writes и система очень загружена, более высокое значение wal_buffers поможет сгладить время отклика в течение периода, непосредственно следующего за каждой контрольной точкой.

Параметр commit_delay определяет, сколько микросекунд процесс-лидер групповой фиксации будет бездействовать после получения блокировки в пределах XLogFlush , в то время как последователи групповой фиксации выстраиваются в очередь за лидером. Эта задержка позволяет другим серверным процессам добавлять свои записи фиксации в буферы WAL, чтобы все они были очищены возможной операцией синхронизации лидера.Спящий режим не произойдет, если fsync не включен или если в активных транзакциях в настоящее время находится менее чем commit_siblings других сеансов; это позволяет избежать сна, когда маловероятно, что какой-либо другой сеанс будет зафиксирован в ближайшее время. Обратите внимание, что на некоторых платформах разрешение запроса на спящий режим составляет десять миллисекунд, поэтому любой ненулевой параметр commit_delay от 1 до 10000 микросекунд будет иметь тот же эффект. Также обратите внимание, что на некоторых платформах спящие операции могут занимать немного больше времени, чем требуется параметром.

Поскольку цель commit_delay состоит в том, чтобы обеспечить амортизацию стоимости каждой операции сброса между одновременно совершаемыми транзакциями (возможно, за счет задержки транзакции), необходимо количественно оценить эту стоимость, прежде чем параметр можно будет выбрать разумно. Чем выше эта стоимость, тем эффективнее будет commit_delay для увеличения пропускной способности транзакций, до определенного момента. Программу pg_test_fsync можно использовать для измерения среднего времени в микросекундах, которое занимает одна операция очистки WAL.Значение, составляющее половину среднего времени, которое, по сообщениям программы, требуется для очистки после одной операции записи 8 КБ, часто является наиболее эффективной настройкой для commit_delay, поэтому это значение рекомендуется использовать в качестве отправной точки при оптимизации для конкретной рабочей нагрузки. Хотя настройка commit_delay особенно полезна, когда журнал WAL хранится на вращающихся дисках с высокой задержкой, преимущества могут быть значительными даже на носителях с очень быстрым временем синхронизации, таких как твердотельные накопители или массивы RAID с кэшем записи с резервным питанием от батареи; но это обязательно должно быть проверено на репрезентативной рабочей нагрузке.В таких случаях следует использовать более высокие значения commit_siblings, тогда как меньшие значения commit_siblings часто полезны для носителей с более высокой задержкой. Обратите внимание, что вполне возможно, что слишком высокое значение параметра commit_delay может увеличить задержку транзакций настолько, что пострадает общая пропускная способность транзакций.

Если для параметра commit_delay установлено значение ноль (по умолчанию), по-прежнему возможна групповая фиксация, но каждая группа будет состоять только из сеансов, достигших точки, в которой им необходимо сбросить свои записи фиксации в течение окна, в котором выполняется предыдущая операция сброса (если есть).При большем количестве клиентов имеет тенденцию возникать «эффект прохода», так что эффекты групповой фиксации становятся значительными, даже когда commit_delay равен нулю, и, таким образом, явная установка commit_delay помогает меньше. Установка commit_delay может помочь только тогда, когда (1) есть несколько одновременно совершаемых транзакций и (2) пропускная способность в некоторой степени ограничена скоростью фиксации; но с высокой задержкой вращения этот параметр может быть эффективным для увеличения пропускной способности транзакций всего с двумя клиентами (то есть, один фиксирующий клиент с одной родственной транзакцией).

Параметр wal_sync_method определяет, как PostgreSQL будет запрашивать у ядра принудительное сохранение обновлений WAL на диск. Все параметры должны быть одинаковыми с точки зрения надежности, за исключением fsync_writethrough, который иногда может принудительно сбросить кэш диска, даже если другие параметры этого не делают. Тем не менее, какая из них будет самой быстрой, зависит от конкретной платформы. Вы можете протестировать скорость различных опций с помощью программы pg_test_fsync. Обратите внимание, что этот параметр не имеет значения, если fsync отключен.

Включение параметра конфигурации wal_debug (при условии, что PostgreSQL был скомпилирован с его поддержкой) приведет к тому, что каждый вызов XLogInsertRecord и XLogFlush WAL будет регистрироваться в журнале сервера. Этот вариант может быть заменен более общим механизмом в будущем.

Пять советов, которые вы можете использовать прямо сейчас при прохождении проверки на контрольно-пропускном пункте TSA

ВАШИНГТОН, округ Колумбия — Управление транспортной безопасности (TSA) готово к поездкам на весенние каникулы, но что могут сделать путешественники, чтобы подготовиться к проверке на контрольно-пропускном пункте в аэропорту во время пандемии? TSA делится этими пятью советами, которые помогут вам пройти через контрольно-пропускной пункт, и вы можете использовать их прямо сейчас, чтобы сохранить здоровье и безопасность при прохождении проверки безопасности.

1. Сокращение точек соприкосновения. TSA предпринимает шаги по сокращению точек соприкосновения на контрольно-пропускных пунктах, и путешественники могут сделать то же самое. Когда приходит время пройти через досмотровое оборудование на контрольно-пропускном пункте, путешественники должны вынуть все предметы из карманов. При этом кладите эти предметы (ключи, бумажник, мобильный телефон, бальзам для губ и т. д.) непосредственно в ручную кладь, а не в мусорное ведро контрольно-пропускного пункта, чтобы уменьшить количество точек соприкосновения между вашими вещами и мусорными баками. Если на контрольно-пропускном пункте есть компьютерный томограф, путешественники могут оставить свою электронику в ручной клади, поэтому обратите внимание на указания сотрудника TSA о том, какие предметы можно оставить в ручной клади.
2. Упакуйте дополнительную маску. Лица, находящиеся в аэропортах и ​​самолетах, должны носить маску, поэтому не забудьте надеть маску. Если вы не надели маску на контрольно-пропускном пункте, сотрудник TSA напомнит вам надеть ее. Отказ сделать это означает, что вас не пропустят через контрольно-пропускной пункт. Подавляющее большинство пассажиров соблюдают требование ношения масок. Умные путешественники берут с собой в поездку одну или две дополнительные маски на случай, если эластичный ремешок порвется, их маска загрязнится, или чтобы заменить новую маску на ту, которую носили несколько часов.Подумайте о том, чтобы упаковать еще один — на тот случай, если окажется, что он вам нужен.
3. Возьмите с собой дезинфицирующее средство для рук и салфетки. TSA позволяет путешественникам проносить до одного контейнера с жидким дезинфицирующим средством для рук на 12 унций на человека через контрольно-пропускной пункт. Это добавит вам немного времени на проверку на контрольно-пропускном пункте, но оно того стоит. Кроме того, люди могут проносить дезинфицирующие салфетки через контрольно-пропускные пункты. Количество дезинфицирующих салфеток не ограничено, поэтому возьмите с собой салфетки и жидкое дезинфицирующее средство для рук.
4. Умная упаковка. Путешественникам необходимо знать, что можно и что нельзя брать с собой в ручную кладь. Сейчас как никогда важно знать, какие предметы не следует упаковывать в ручную кладь, потому что, если ручная кладь вызывает тревогу, сотруднику TSA потребуется открыть сумку, чтобы снять тревогу. Это означает, что офицеру TSA придется открыть ваш багаж и зайти внутрь, чтобы определить, какой предмет мог вызвать тревогу. Помните, что во время пандемии крайне важно сократить количество точек соприкосновения, поэтому не берите с собой запрещенные предметы.Не уверены, следует ли упаковывать предмет в ручную кладь, зарегистрированный багаж или ни в то, ни в другое? Загрузите бесплатное приложение myTSA, в котором есть удобный раздел «Что я могу принести?» функция, которая позволяет вам ввести предмет, чтобы узнать, может ли он летать. Или спросите нас в Twitter или Facebook Messenger по адресу @AskTSA.
5. Упакуйте продукты в прозрачный пластиковый пакет. Если вы планируете путешествовать с едой, рекомендуется упаковать продукты в прозрачный пластиковый пакет и положить этот прозрачный пластиковый пакет в ручную кладь. Когда вы доберетесь до контрольно-пропускного пункта, снимите прозрачный пакет с едой и поместите этот пакет в мусорное ведро, чтобы уменьшить возможность перекрестного загрязнения между едой и мусорными ведрами.Зачем вообще отказываться от еды? Некоторые продукты питания могут вызывать тревогу во время досмотра, поэтому вместо того, чтобы сотруднику TSA приходилось открывать ручную кладь, чтобы проверить, что вызвало тревогу, удаление вашей еды снижает вероятность необходимости досмотра сумки.

Напоминаем, что с 1 октября каждому авиапассажиру в возрасте 18 лет и старше потребуется водительское удостоверение, соответствующее НАСТОЯЩЕМУ удостоверению личности, расширенное водительское удостоверение, выданное штатом, или другое приемлемое удостоверение личности для полета в Соединенных Штатах.Поэтому подумайте о том, чтобы посетить местный отдел автотранспортных средств, чтобы обновить свои водительские права.

###

Удаление контрольной точки резервного копирования в Hyper-V, не имеющей возможности удаления

Hyper-V не требует особого обслуживания, но время от времени вы можете увидеть контрольную точку (ранее называвшуюся моментальным снимком), прикрепленную к виртуальной машине (ВМ), которую нельзя удалить, поскольку возможность удаления недоступна. Я столкнулся с этим в Hyper-V, работающем в центре обработки данных Windows Server 2012 R2.Однажды что-то пошло не так с резервной копией сервера, и я заметил контрольную точку, которую не создавал. Он был создан сторонним приложением, которое я использовал для резервного копирования контрольных точек. Контрольная точка называлась ServerName — Backup , где ServerName — это имя виртуальной машины. Я хотел экспортировать виртуальную машину и не хотел иметь контрольные точки в резервной копии. У меня уже была резервная копия виртуальной машины, и все работало нормально, поэтому меня не особо заботила резервная копия, созданная системой.Когда я щелкнул правой кнопкой мыши контрольную точку, чтобы удалить ее, я заметил, что параметр «Удалить контрольную точку» недоступен. Вот что я увидел.

Обратите внимание, что на приведенном выше снимке экрана отсутствуют параметры Удалить контрольную точку и Удалить поддерево контрольной точки . Вот какие есть варианты для стандартной контрольной точки.

Если вы столкнулись с такой ситуацией, сначала попробуйте следующие методы.

1. Щелкните правой кнопкой мыши имя хост-сервера в диспетчере Hyper-V на левой панели и выберите «Обновить».
2. Закройте и снова откройте диспетчер Hyper-V.
3. Выделите контрольную точку и используйте клавишу Delete на клавиатуре.

Если ни один из этих советов не помог, используйте PowerShell, чтобы избавиться от нежелательных контрольных точек. Это относится к любой контрольной точке, которую вы хотите удалить.

Чтобы удалить контрольную точку в Hyper-V, используйте следующие инструкции. Скрипт должен работать на Hyper-V, установленном на любой операционной системе, например.г. Windows Server 2008, Windows Server 2012, Windows Server 2016, Windows 10 и т. д.

1. Запустите PowerShell на компьютере, где находится виртуальная машина. Я предпочитаю использовать PowerShell ISE.
2. Введите следующую команду и нажмите Enter. Параметр VMSnapshot относится к контрольной точке виртуальной машины. Как я упоминал ранее, контрольная точка раньше называлась моментальным снимком в Hyper-V до того, как Microsoft изменила свое название.
   Get-VMSnapshot -ComputerName <Имя-компьютера> -VMName <Имя-ВМ> | Remove-VMSnapshot
   Вертикальная черта — это символ вертикальной черты над клавишей Enter на стандартной клавиатуре.Если ваш компьютер называется SERVER1, а имя виртуальной машины — SQLServer, вы будете использовать следующую команду. Убедитесь, что вы используете имя виртуальной машины, а не имя контрольной точки. Следующая команда будет работать, если у вас есть только одна контрольная точка, которую необходимо удалить. Параметр -ComputerName является необязательным, но необходимо указать параметр VMName. Другими словами, любая из следующих команд должна работать.
   Get-VMSnapshot -ComputerName «SERVER1» -VMName «SQLServer» | Remove-VMSnapshot
   или
   Get-VMSnapshot -VMName «SQLServer» | Remove-VMSnapshot
   
3. Если у вас несколько контрольных точек, используйте параметр -Name < Checkpoint-Name >   в конце.Например, если виртуальная машина называется CONTOSO, а контрольная точка, которую вы хотите удалить, называется CONTOSO – (06.09.2018 – 20:07:13), команда будет иметь следующий вид:
   Get-VMSnapshot -VMName «CONTOSO » -Name «CONTOSO — (20.06.2018 — 10:48:49)» | Remove-VMSnapshot
   
   
4. Как только контрольная точка будет удалена, Hyper-V запустит процесс слияния в диспетчере Hyper-V. В зависимости от размера виртуального жесткого диска процесс слияния может занять некоторое время, так что наберитесь терпения.
5. Если вам нужно экспортировать виртуальную машину, вы сможете продолжить после завершения слияния.

Статья обновлена: 13.09.18

Copyright © 2017 SeattlePro Enterprises, LLC. Все права защищены.

Дрожжи Fin1-PP1 дефосфорилируют субстрат Ipl1, Ndc80, для удаления контрольных белков Bub1-Bub3 из кинетохоры во время анафазы

Abstract

Контрольная точка сборки веретена (SAC) предотвращает начало анафазы в ответ на дефекты прикрепления хромосом, а молчание SAC необходимо для наступления анафазы.После начала анафазы активированная фосфатаза Cdc14 дефосфорилирует субстраты циклин-зависимой киназы, чтобы облегчить прогрессирование анафазы и выход из митоза. У почкующихся дрожжей Cdc14 дефосфорилирует Fin1, регуляторную субъединицу протеинфосфатазы 1 (PP1), чтобы обеспечить кинетохорную локализацию Fin1-PP1. Ранее мы показали, что локализованный в кинетохоре Fin1-PP1 способствует удалению белка SAC Bub1 из кинетохоры во время анафазы. Мы сообщаем здесь, что Fin1-PP1 также способствует удалению кинетохор Bub3, партнера Bub1, но не влияет на др. белок SAC Mad1.Более того, локализация кинетохор Bub1-Bub3 во время анафазы требует активности киназы Aurora B/Ipl1. Далее мы показали, что Fin1-PP1 облегчает дефосфорилирование кинетохорного белка Ndc80, известного субстрата Ipl1. Это дефосфорилирование уменьшает ассоциацию кинетохор Bub1-Bub3 во время анафазы. Кроме того, мы обнаружили, что несвоевременное дефосфорилирование Ndc80 вызывает потерю жизнеспособности в ответ на прикрепление хромосом без натяжения. Эти результаты указывают на то, что своевременная локализация Fin1-PP1 в кинетохоре контролирует функциональное окно SAC и, следовательно, имеет решающее значение для достоверной сегрегации хромосом.

Резюме автора

Ошибки в прикреплении хромосом активируют контрольную точку узла веретена, чтобы остановить клеточный цикл для исправления ошибок. Эта активация зависит от рекрутирования кинетохорами белков контрольных точек, включая комплекс Bub1-Bub3. После того, как клетки установили биполярное прикрепление хромосом, контрольная точка сборки веретена подавляется протеинфосфатазой 1 (PP1), чтобы обеспечить вход в анафазу. Fin1 является регуляторной субъединицей PP1 у почкующихся дрожжей, и Fin1 рекрутирует PP1 на кинетохоры во время анафазы, когда контрольная точка сборки веретена замолкает.Ранее мы показали, что Fin1-PP1 способствует диссоциации белка контрольной точки Bub1 от кинетохоры во время анафазы, обнаруживая неожиданную регуляцию контрольной точки сборки веретена после ее молчания. Здесь мы показали, что Fin1-PP1 способствует диссоциации кинетохор как Bub1, так и Bub3 во время анафазы, и что ассоциация кинетохор Bub1 и Bub3 взаимозависима. Было показано, что PP1 противодействует фосфорилированию, вызываемому Ipl1/Aurora B, консервативной протеинкиназой, необходимой для точного расхождения хромосом.Далее мы обнаружили, что Fin1-PP1 способствует дефосфорилированию кинетохорного белка Ndc80, субстрата Ipl1, что уменьшает ассоциацию кинетохор Bub1-Bub3. Более того, нарушение регуляции фосфорилирования Ndc80 приводит к повышенной потере жизнеспособности, когда индуцируется синтетическое прикрепление. Таким образом, мы идентифицировали новый уровень регуляции контрольной точки сборки веретена во время анафазы, который обеспечивает его функциональное окно во время клеточного цикла.

Образец цитирования: Bokros M, Sherwin D, Kabbaj M-H, Wang Y (2021) Дрожжи Fin1-PP1 дефосфорилируют субстрат Ipl1, Ndc80, для удаления белков контрольных точек Bub1-Bub3 из кинетохоры во время анафазы.PLoS Genet 17(5): е1009592. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592

Редактор: Грегори П. Копенхейвер, Университет Северной Каролины в Чапел-Хилл, США

Получено: 24 ноября 2020 г.; Принято: 10 мая 2021 г .; Опубликовано: 25 мая 2021 г.

Copyright: © 2021 Bokros et al. Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные содержатся в рукописи и файлах вспомогательной информации.

Финансирование: Ю.В. получил поддержку (грант № R01GM121786) от Национального института здоровья. Спонсоры не участвовали в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Во время клеточного деления хромосомы равномерно распределяются в дочерние клетки, и правильное разделение хромосом необходимо для поддержания целостности генома всех живых организмов.Нарушение этого процесса приводит к анеуплоидии, отличительной черте рака и генетических заболеваний, таких как трисомия 21 [1,2]. Во время метафазы хромосомы прикрепляются к микротрубочкам через их кинетохоры двунаправленным образом, создавая натяжение. Неправильные соединения между кинетохорой и микротрубочками веретена активируют контрольную точку сборки веретена (SAC), чтобы предотвратить начало анафазы. Активация SAC зависит от рекрутирования белков SAC на кинетохоры [3]. Кроме того, активация SAC зависит от тонкого баланса между активностью киназы и фосфатазы.Фосфорилирование мотивов MELT в кинетохорном белке Spc105 с помощью SAC-киназы Mps1 способствует его ассоциации с SAC-белками Bub3 и Bub1. Bub1 дополнительно рекрутирует белки SAC Mad1 и Mad2 для активации SAC [4-6].

У почкующихся дрожжей прикрепление без напряжения задерживает начало анафазы, предотвращая молчание SAC, и эта задержка зависит от Ipl1, гомолога киназы Aurora B человека [7,8]. Ipl1 ^Aurora-B вместе с Sli15 ^INCENP , Bir1 ^Survivin и Nbl1 ^Borealin составляют хромосомный пассажирский комплекс (CPC).Наша предыдущая работа показывает, что киназа Ipl1 предотвращает молчание SAC в присутствии прикреплений без натяжения посредством фосфорилирования кинетохорного белка Dam1 [9,10]. Кроме того, фосфорилирование Dam1 дестабилизирует взаимодействие кинетохора-микротрубочки. Следовательно, Ipl1-зависимое фосфорилирование Dam1 не только облегчает коррекцию ошибок прикрепления, но также предотвращает преждевременное замалчивание SAC. Хотя подавление SAC требует увеличения активности фосфатазы в кинетохоре, механизмы, которые контролируют баланс киназы/фосфатазы во время клеточного цикла, остаются неясными.Предполагается, что напряжение, создаваемое биполярным прикреплением хромосом, запускает изменение баланса для молчания SAC [11,12].

Сайленсинг SAC позволяет начать анафазу, которая запускает дальнейшее клеточное изменение баланса киназы/фосфатазы. Было показано, что у почкующихся дрожжей активность фосфатазы Cdc14 увеличивается в анафазе, чтобы противодействовать циклинзависимой киназы (CDK). Активность Cdc14 регулируется его субклеточной локализацией. Перед началом анафазы Cdc14 секвестрируется внутри ядрышка путем связывания с ядрышковыми белками Net1/Cfi1 и Tof2 [13-15].После начала анафазы Cdc14 временно высвобождается из ядрышка, и этот процесс контролируется путем раннего высвобождения Cdc14 в анафазе (FEAR). Зависимое от FEAR высвобождение Cdc14 меняет фосфорилирование, вызванное CDK S-фазы, для обеспечения ранних событий анафазы [16,17]. Поскольку было идентифицировано около дюжины субстратов S-фазы CDK [18], необходима дополнительная работа, чтобы понять функцию дефосфорилирования каждого субстрата.

Недавно мы обнаружили, что Fin1, регуляторная субъединица протеинфосфатазы 1 (PP1), модулируется осью CDK-Cdc14 для дальнейшего подавления SAC во время анафазы [19,20].CDK S-фазы фосфорилирует Fin1, чтобы способствовать его связыванию с Bmh2 и Bmh3, которые секвестрируют Fin1 и предотвращают его локализацию в кинетохоре [21,22]. После начала анафазы и активации FEAR Cdc14 дефосфорилирует Fin1 и обеспечивает прочное связывание с кинетохорами. Ранее мы обнаружили, что в отсутствие Fin1 белок SAC Bub1 остается на кинетохоре во время анафазы, что указывает на то, что Fin1-PP1 функционирует для удаления белков SAC во время анафазы [19]. Наоборот, преждевременная локализация кинетохор Fin1-PP1, вероятно, ставит под угрозу активность SAC и приводит к чувствительности к индукции синтетических прикреплений хромосом, состоянию, при котором обе сестринские кинетохоры прикрепляются микротрубочками к одному и тому же полюсу веретена.Дальнейшее подтверждение этой идеи заключается в том, что активация фосфатазы Cdc14, которая обращает фосфорилирование, вызванное CDK, также предотвращает реактивацию SAC у почкующихся дрожжей [23]. Однако молекулярный механизм, с помощью которого Fin1-PP1 регулирует активность SAC, остается неясным.

Здесь мы дополнительно исследовали, как комплекс Fin1-PP1 способствует удалению белков SAC из кинетохора во время анафазы. Во-первых, мы обнаружили, что в дополнение к Bub1 комплекс Fin1-PP1 также способствует удалению кинетохор партнера Bub1 Bub3 во время анафазы.Более того, локализация кинетохор Bub1 и Bub3 взаимозависима, указывая на то, что образование комплекса Bub1-Bub3 является критическим для локализации их кинетохор. В дополнение к Dam1 киназа Ipl1 также фосфорилирует Ndc80, субъединицу кинетохорного комплекса, который взаимодействует как с внутренним кинетохорным комплексом, так и с комплексом Dam1, ассоциированным с микротрубочками [24]. Мы показали, что Fin1-PP1 способствует дефосфорилированию Ndc80, чтобы предотвратить реассоциацию Bub1-Bub3 с кинетохорой во время анафазы. Подобно клеткам с усиленной локализацией кинетохор Fin1, фосфо-дефицитная мутация в Ndc80 также вызывает потерю жизнеспособности в клетках с прикреплением синтетических хромосом.Вместе наша исследовательская работа выявила механизм удаления белка SAC из кинетохора с помощью Fin1-PP1 после подавления SAC. Выявление этого механизма демонстрирует важность жесткого контроля баланса киназы-фосфатазы в кинетохоре при правильном расхождении хромосом.

Результаты

Fin1-PP1 предотвращает реассоциацию белков SAC Bub1 и Bub3 с кинетохорой в анафазе

Ранее мы обнаружили, что мутантные клетки fin1Δ сохраняли кинетохорную локализацию белка Bub1 SAC во время анафазы [19].Однако остается неясным, является ли локализация кинетохор Bub1 в fin1Δ мутантных клетках во время анафазы постоянной или динамической. Поэтому мы проследили локализацию кинетохор Bub1 с помощью визуализации живых клеток в клетках дикого типа (WT) и fin1Δ , экспрессирующих Bub1-GFP и установленный маркер кинетохор Nuf2-mCherry [25]. Во время начала анафазы клетки WT и fin1Δ практически не обнаруживали локализацию кинетохор Bub1. После начала анафазы только 7% клеток WT демонстрируют слабую локализацию кинетохор Bub1 в одном или нескольких временных промежутках во время анафазы.Поразительно, 91% мутантных клеток fin1Δ демонстрировали Bub1-GFP на кинетохоре во время анафазы (рис. 1А). Кроме того, локализация Bub1 на кинетохоре во время анафазы была динамической в ​​ мутантных клетках fin1Δ , чередуя ассоциацию и диссоциацию на протяжении анафазы. Ассоциация кинетохор Bub1 произошла в 35% всех кадров после начала анафазы в клетках fin1Δ . Более того, мы заметили, что локализация кинетохор Bub1 не была равномерно распределена между двумя кластерами кинетохор в клетках fin1Δ , что подтверждает идею о том, что локализация кинетохор Bub1 в мутантных клетках fin1Δ во время анафазы является динамическим процессом (рис. 1В).Мы считаем, что Fin1-PP1 предотвращает повторную ассоциацию кинетохор SAC белка Bub1 после входа в анафазу.

Рис. 1. Fin1 способствует диссоциации Bub1 от кинетохоры во время анафазы.

(A) Визуализация живых клеток WT (2827-1-4) и fin1Δ (3196-1-3) клеток для демонстрации связи Bub1 с кинетохорой в анафазе. Логарифмическую фазу WT и клеток fin1Δ с Bub1-GFP и Nuf2-mCherry в среде дрожжевого пептона и декстрозы (YPD) наносили на поверхность предметного стекла, покрытого агарозной средой, и подвергали микроскопии живых клеток.Мы устанавливаем время 0 как последнюю точку, когда расстояние между двумя фокусами Nuf2-mCherry составляет менее 3 мкм. Стрелки указывают на совместную локализацию Bub1-GFP Nuf2-mCherry. Клетки, которые имели совместную локализацию Bub1-GFP с Nuf2-mCherry в любое время во время анафазы, считали положительными, и процент положительных клеток наносили на график (n = 20). КТ: кинетохора. (B) Совместная локализация Bub1-GFP с кинетохорой после начала анафазы является динамической. Паттерн локализации Bub1 с одним или обоими кластерами кинетохор был подсчитан для репрезентативного WT и клеток fin1Δ во время анафазы (n = 5).Желтые стрелки указывают кластер кинетохор; белые стрелки указывают локализацию кинетохор Bub1. Масштабная линейка, 2,5 мкм. Наличие (1) или отсутствие (0) совместной локализации между Bub1-GFP и Nuf2-mCherry во времени показано на нижней правой панели.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592.g001

Fin1-PP1 предотвращает анафазную локализацию кинетохор как Bub1, так и Bub3

Первым этапом сборки SAC на кинетохоре является ассоциация Bub3 с мотивами MELT Spc105 после фосфорилирования Spc105 киназой Mps1 [4,6].Далее следует Bub1, связывающийся с Bub3 через его Gle2-связывающую последовательность [26,27]. Поскольку мы показали сохранение Bub1 на кинетохорах анафазы в клетках fin1Δ [19], мы также отследили локализацию кинетохор Bub3 в мутантных клетках fin1Δ . Мы использовали чувствительный к температуре мутант cdc15-2 для остановки клеток в телофазе и исследовали совместную локализацию Bub3-GFP с кинетохорным маркером Nuf2-mCherry. В клетках, арестованных cdc15-2 , частота локализации кинетохор Bub3 составляла всего 1%.Однако в тех же условиях 96% клеток fin1Δ показали локализацию кинетохор Bub3 (рис. 2А). Т.о., клетки fin1Δ обнаруживают удержание как Bub1, так и Bub3 на кинетохоре при аресте в телофазе с помощью cdc15-2 . Мы также выполнили визуализацию живых клеток с использованием штаммов с Bub3-GFP и Nuf2-mCherry и наблюдали повышенную ассоциацию Bub3-кинетохор в клетках fin1Δ (рис. S1A). Только 5% клеток WT показали локализацию кинетохор Bub3 в анафазе по сравнению с 85% мутантных клеток fin1Δ (S1B Fig).Bub3 также показал динамическую локализацию кинетохор во время анафазы, поскольку 39% кадров клеток fin1Δ во время анафазы показали локализацию кинетохор Bub3 по сравнению с 2% для клеток WT (рис. S1C). Мы признаем, что количество клеток fin1Δ , демонстрирующих локализацию кинетохор Bub1 или Bub3 при аресте с помощью cdc15-2 , заметно выше, чем частота, представленная в данных визуализации живых клеток. Мы считаем, что в мутантных клетках cdc15-2 инактивация сети выхода из митоза может усугубить фенотип fin1Δ .

Хотя сильная кинетохорная ассоциация комплекса Bub1-Bub3 была замечена в мутантных клетках cdc15-2 fin1Δ в анафазе, Mad1 не был обнаружен в анафазной кинетохоре в cdc15-2 fin1Δ или асинхронных fin1Δ анафазных клетках (рис. S2) . В этих клетках Mad1 показал характерную локализацию ядерной оболочки, как описано [28]. Т.о., особый механизм контролирует диссоциацию кинетохор Mad1, что, вероятно, является ключом к молчанию SAC.

Рис. 2.Локализация кинетохор Bub1 и Bub3 в анафазе взаимозависима.

(A) Bub3 показывает локализацию кинетохор в клетках fin1Δ во время анафазы, и эта локализация зависит от Bub1. Клетки WT (3888-11-2), fin1Δ (3890-14-3) и fin1Δ bub1Δ (4065-4-3) на фоне cdc15-2 , содержащем Bub3-GFP и Nuf2-mCherry, были выращивали до логарифмической фазы при 25°С. Затем клетки переводили в непермиссивную температуру 37°C на 180 минут, чтобы обеспечить инактивацию Cdc15.Взяли пробы и сделали фотографии. Для каждого штамма подсчитывали частоту совместной локализации сигналов Bub3-GFP и Nuf2-mCherry (n = 100). Белые стрелки указывают на совместную локализацию Bub3-кинетохор. Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. Масштабная линейка, 5 мкм. Отношение интенсивности Bub3-GFP на кинетохоре по сравнению с другими ядерными областями также измеряли с помощью ImageJ (n = 20). Среднее соотношение показано на нижней правой панели.Статистическая значимость определена как p <0,05 с использованием однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. (B) Локализация кинетохор Bub1 в анафазных fin1 Δ клетках зависит от Bub3. Клетки WT (3177-3-4), fin1Δ (3196-3-1) и fin1Δ bub3Δ (3905-6-1) на фоне cdc15-2 , содержащем Bub1-GFP и Nuf2-mCherry, были выращивают, как описано выше. Для каждого штамма подсчитывали частоту совместной локализации Bub1-GFP и Nuf2-mCherry (n = 100).Белые стрелки указывают на совместную локализацию Bub1-кинетохор. Эксперимент повторяли три раза и определяли статистическую значимость, как описано выше. Масштабная линейка, 5 мкм. Отношение интенсивности Bub1-GFP на кинетохоре по сравнению с другими областями ядра также измеряли с помощью ImageJ (n = 20). Среднее соотношение показано на нижней правой панели. Статистическая значимость определена как p <0,05 с использованием однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. (C) Локализация кинетохор Bub1 в обработанных нокодазолом клетках зависит от Bub3.Клетки WT (3887-4-1) и bub3Δ (3887-3-4) с Bub1-GFP и Nuf2-mCherry выращивали до логарифмической фазы при 25°C. К культурам клеток добавляли нокодазол до конечной концентрации 20 мкг/мл. После инкубации в течение 120 минут образцы собирали и фотографировали. Эксперимент повторяли трижды и определяли статистическую значимость. Масштабная линейка, 5 мкм. (D) Локализация кинетохор Bub3 в обработанных нокодазолом клетках зависит от Bub1. Клетки WT (4065-8-1) и bub1Δ (4065-3-1) с Bub3-GFP и Nuf2-mCherry обрабатывали, как в (C).Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. Масштабная линейка, 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592.g002

Ассоциация кинетохор Bub1 и Bub3 взаимозависима

Более ранние данные свидетельствуют о том, что Bub3 является первоначальным белком, связывающим кинетохор во время активации SAC, и что Bub1 впоследствии связывается с Bub3 [27,29,30]. Чтобы проверить зависимость локализации кинетохор анафазы Bub1 от Bub3, мы исследовали локализацию кинетохор Bub1 в fin1Δ bub3Δ мутантных клетках, арестованных с помощью cdc15-2 .В клетках, задержанных в телофазе, частота локализации кинетохор Bub1 составляла около 1%, тогда как в клетках fin1Δ она составляла около 90%, как и ожидалось. Однако локализация кинетохор в анафазе Bub1 была полностью устранена у двойных мутантов fin1Δ bub3Δ (рис. 2B). Мы также измерили отношение интенсивности Bub1-GFP на кинетохоре по отношению к другим областям ядра. Это соотношение для клеток cdc15-2 было близко к единице, что указывает на отсутствие кинетохорного обогащения Bub1, однако отношение увеличилось до 1.4 в клетках cdc15-2 fin1Δ , что указывает на обогащение кинетохорами Bub1. Это обогащение было отменено в клетках cdc15-2 bub3Δ fin1Δ , что позволяет предположить, что это обогащение зависит от Bub3 (рис. 2B). Используя аналогичный протокол, мы также исследовали зависимость анафазной локализации кинетохор Bub3 от Bub1. В мутантных клетках fin1Δ bub1Δ анафазная локализация кинетохор Bub3 также была полностью устранена, и только 1% клеток демонстрировали локализацию кинетохор Bub3 (рис. 2А).Более того, Bub1-зависимое обогащение Bub3 в кинетохоре подтверждается соотношением интенсивности Bub3-GFP в кинетохоре по отношению к другим областям ядра (Fig. 2A). Эти результаты указывают на взаимозависимость Bub1 и Bub3 для их анафазной локализации кинетохор у fin1Δ мутантов.

Учитывая взаимозависимость Bub1 и Bub3 в их локализации кинетохор во время анафазы у fin1Δ мутантов, мы стремились узнать, существует ли эта взаимозависимость в клетках, обработанных нокодазолом, который деполимеризует микротрубочки и нарушает взаимодействие кинетохор-микротрубочки.Дрожжевые клетки, обработанные нокодазолом, обнаруживают активацию SAC и накопление белков SAC на кинетохоре [31]. После обработки 20 мкг/мл нокодазола 79% дрожжевых клеток дикого типа показали кинетохорную локализацию Bub1, но эта локализация уменьшилась только до 6% в мутантных клетках bub3Δ (рис. 2C). Кроме того, мы исследовали локализацию кинетохор Bub3 в клетках bub1Δ в тех же условиях. В клетках WT, обработанных нокодазолом, 90% показали локализацию кинетохор Bub3. Интересно, что устранение Bub1 почти полностью устранило кинетохорную локализацию Bub3, вплоть до 2% (Fig. 2D).Поскольку активация SAC отменяется у bub1Δ и bub3Δ мутантов, обработанных нокодазолом, мы провели эксперимент в клетках без обработки нокодазолом и исследовали локализацию кинетохор Bub1/Bub3 в метафазных клетках. Точно так же Bub1 и Bub3 показали взаимозависимую локализацию кинетохор (рис. S3). Одно из возможных объяснений заключается в том, что комплексообразование Bub1-Bub3 необходимо для их стабильной локализации кинетохор. Мы заметили, что этот результат не согласуется с опубликованной работой, показывающей, что локализация кинетохор Bub3 не зависит от Bub1 и др. белков контрольных точек [26].Для выяснения этого несоответствия необходимы дальнейшие эксперименты.

Время локализации кинетохор Fin1-PP1 имеет решающее значение для правильной сегрегации хромосом после воздействия ядов веретена

Fin1-PP1 рекрутируется на кинетохору после входа в анафазу [22]. Однако неясно, достаточно ли рекрутирования Fin1-PP1 кинетохор для удаления белков SAC из кинетохор, чтобы инактивировать SAC. Fin1 является субстратом S-фазы CDK и фосфатазы Cdc14, а мутация консенсусных сайтов CDK (S36A, S54A, T68A, S117A, S148A) в гене FIN1 приводит к образованию мутанта fin1-5A .Мутированный Fin1-5A преждевременно локализуется в кинетохоре [19,21]. Поскольку фосфатаза Cdc14 дефосфорилирует Fin1, чтобы обеспечить локализацию кинетохор, мы сначала исследовали локализацию кинетохор Fin1 и Fin1-5A в термочувствительных мутантных клетках cdc14-2 . Fin1-5A, но не Fin1, показал локализацию кинетохор в клетках cdc14-2 , выращенных при 37°C, что указывает на то, что локализация кинетохор Fin1-5A обходит требование Cdc14 (рис. S4). Ранее мы показали, что клетки fin1-5A были чувствительны к индукции синтетического прикрепления и к ядам веретена беномила и нокодазола [19,22].Таким образом, мы также исследовали локализацию кинетохор Fin1-5A в клетках, обработанных нокодазолом. Мы обнаружили, что 83% дрожжевых клеток показали кинетохорную локализацию Fin1-5A-GFP при обработке нокодазолом, в то время как частота была только 10% для Fin1-GFP. Примечательно, что для клеток fin1-5A не наблюдалось значительного повторного отпочкования клеток после высвобождения G ₁ в среду с нокодазолом в течение 120 минут (фиг. 3A), что отличается от ответа мутантов SAC на нокодазол.

Рис. 3.SAC остается интактным в ответ на обработку нокодазолом в клетках с преждевременной локализацией кинетохора Fin1.

(A) Преждевременная кинетохорная ассоциация фосфодефицитных белков Fin1-5A в клетках, задержанных нокодазолом. G ₁ -арестованные клетки, несущие плазмиды FIN1-GFP (pSB1252) или fin1-5A-GFP (pSB1359) и Nuf2-mCherry (3175-1-4), были высвобождены в YPD, содержащем 20 мкг/мл нокодазола для 140 мин при 30°С. Клетки собирали и фиксировали. Подсчитывали индекс почкования и локализацию кинетохор Fin1-GFP (n = 100).Белые стрелки указывают на кинетохорную локализацию Fin1. Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. Масштабная линейка, 5 мкм. (B) Локализация кинетохор Bub1 в клетках, обработанных нокодазолом. G ₁ -арестованные клетки fin1Δ , несущие плазмиду FIN1 (pMB6) или fin1-5A (pMB7), и Bub1-GFP Nuf2-mCherry (3196-1-3) высвобождали в YPD, содержащий 20 мкг/мл нокодазол в течение 140 мин при 30°С.Белые стрелки указывают на кинетохорную локализацию Fin1. Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. Масштабная линейка, 5 мкм. (C) Накопление ингибитора анафазы Pds1 в клетках FIN1 или fin1-5A , обработанных нокодазолом. Арестованные клетки G ₁ , несущие плазмиды FIN1 (pMB6) или fin1-5A (pMB7) с Pds1-18myc (3777-2-1), высвобождали в YPD, содержащем 20 мкг/мл нокодазола, при 30°C.Клетки собирали каждые 20 минут в течение 3 часов для приготовления образцов белка и подсчета индекса почкования. Вестерн-блоттинг исследовали с помощью анти-myc-антитела. Pgk1, управление загрузкой. Картина представляет три экспериментальных повтора. (D) В клетках fin1-5A наблюдается неправильная сегрегация хромосом после освобождения от нокодазолового ареста. Арестованные клетки G ₁ (2167-17-2), несущие плазмиды FIN1 (pMB6) или fin1-5A (pMB7), высвобождали в среду YPD, содержащую 20 мкг/мл нокодазола, на 120 минут при 30°C.После вымывания нокодазола клетки собирали для определения индекса почкования (вверху слева). Клетки также собирали и высевали на планшеты YPD для изучения эффективности посева, внизу слева (n ≥ 300). Кроме того, клетки собирали с течением времени и фиксировали для визуализации морфологии веретена (Tub1-mCherry) и сегрегации CEN4- GFP. Процент клеток с неправильной сегрегацией CEN4- GFP показан на верхней правой панели (n ≥ 100). Репрезентативные изображения показаны на нижней правой панели. Стрелка указывает на неправильную сегрегацию CEN4- GFP.Масштабная линейка, 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592.g003

Чтобы проверить, достаточно ли привлечения кинетохор Fin1-PP1 для вытеснения белков SAC из кинетохоры, мы проанализировали локализацию кинетохор Bub1 в fin1Δ BUB1-GFP NUF2. — клетки mCherry , несущие либо плазмиду WT FIN1 , либо fin1- 5 A . Обработанные нокодазолом клетки с плазмидой FIN1 или fin1-5A показали высокую частоту локализации Bub1-кинетохор на уровне 91% и 93% соответственно (рис. 3B).Этот результат предполагает, что преждевременной ассоциации кинетохор Fin1-PP1 недостаточно для удаления Bub1-Bub3 из кинетохоры. Для дальнейшей оценки активности SAC в клетках fin1-5A была проанализирована кинетика деградации Pds1. Pds1 является ингибитором анафазы, и активация SAC предотвращает деградацию Pds1 [32]. Уровни Pds1 измеряли в синхронизированных клетках FIN1 и fin1-5A , обработанных 20 мкг/мл нокодазола. В клетках дикого типа уровни Pds1 увеличивались и оставались постоянными.Точно так же клетки fin1-5A также демонстрировали постоянные уровни Pds1 в присутствии нокодазола, что свидетельствует об активации SAC (рис. 3C). Мы также задались вопросом, может ли SAC в fin1-5A в конечном итоге ослабнуть в течение более длительного периода времени. Чтобы проверить это, мы проследили динамику удлинения веретена в течение 5 часов в чувствительных к температуре мутантных клетках ctf13-30 , которые останавливаются в метафазе из-за нарушения функции кинетохор [33]. Интересно, что клетки ctf13-30 , несущие плазмиду FIN1 или fin1-5A , представлены короткими веретенами, что указывает на остановку метафазы [34] (S5A Fig).Это означает, что преждевременной локализации кинетохор Fin1-PP1 недостаточно для инактивации SAC, когда прикрепление кинетохор было нарушено. Одним из объяснений является то, что активация SAC перевешивает негативную регуляцию SAC с помощью Fin1-PP1 в клетках с дефектами прикрепления кинетохор.

Наш результат показывает, что клетки fin1-5A проявляют интактную активность SAC в ответ на обработку нокодазолом или дефектную функцию кинетохор. Чтобы лучше понять чувствительность мутантов fin1-5A к ядам веретена, мы проследили сегрегацию хромосом в клетках с GFP-маркированной центромерой хромосомы IV ( CEN4- GFP) и Tub1-mCherry после воздействия нокодазола.G ₁ -синхронизированные клетки с плазмидами, содержащими FIN1 или fin1-5A , высвобождали в нокодазол (20 мкг/мл) на 2 часа. Эти клетки были эффективно остановлены нокодазолом в виде крупных почкующихся клеток. После того, как эти клетки были распределены на планшеты YPD, 85% клеток FIN1 были жизнеспособными, в то время как только 40% клеток fin1-5A были жизнеспособны (рис. 3D). Мы также проследили сегрегацию CEN4 -GFP в этих клетках. После вымывания нокодазола в течение 10 минут наблюдали образование веретена.Через 40 минут некоторые клетки показали удлиненное веретено, а 16% клеток fin1-5A с анафазным веретеном показали CEN4 -GFP миссегрегацию, в то время как это число составляло только 3% в клетках FIN1 (рис. 3D). Мы повторили эксперимент с использованием клеток без обработки нокодазолом, и для клеток, экспрессирующих fin1-5A , не наблюдалось неправильной сегрегации хромосом или потери жизнеспособности (рис. S5B). Эти результаты показывают, что преждевременная локализация кинетохор Fin1-5A не нарушает активацию SAC в ответ на лечение нокодазолом, но приводит к более высокой частоте неправильной сегрегации хромосом во время восстановления после нокодазоловой остановки.Несвоевременная локализация кинетохоры Fin1-5A может преждевременно удалить Bub1 из кинетохоры, что приведет к неправильной сегрегации хромосом из-за роли Bub1 в биоориентации и контроле контрольных точек [35,36].

Локализация кинетохор Bub1-Bub3 в анафазе зависит от активности CPC

Фосфорилирование белков кинетохор киназой Ipl1 усиливает активность SAC до наступления анафазы [9,24,37]. Было показано, что PP1 противодействует киназе Ipl1 во время анафазы [38]. Т.о., Fin1-PP1, вероятно, противодействует активности Ipl1, чтобы регулировать локализацию Bub1 на кинетохоре в анафазе.Если это так, то ингибирование активности киназы Ipl1 должно отменять анафазную локализацию кинетохор Bub1-Bub3 в клетках fin1Δ . Чтобы проверить эту идею, мы проследили локализацию кинетохор Bub1 в клетках fin1Δ , fin1Δ sli15-3 и fin1Δ ipl1-321 с помощью Bub1-GFP и Nuf2-mCherry. При рестриктивной температуре киназная активность Ipl1 подавляется как у мутантов sli15-3 , так и у мутантов ipl1-321 , поскольку Sli15 связывается с Ipl1 и необходим для киназной активности Ipl1 [39].Асинхронные клетки в середине логарифмической фазы при 25°С переводили на 37°С на 2 часа. Bub1-GFP локализуется в кинетохорах анафазы в 37% из клеток fin1Δ . Локализация кинетохор Bub1-GFP снизилась до 11% в анафазных клетках fin1Δ ipl1-321 и 14% в клетках fin1Δ sli15-3 (рис. 4А). Чтобы подтвердить, что комплекс Bub1-Bub3 в совокупности зависит от активности CPC, мы провели тот же эксперимент с использованием штаммов с Bub3-GFP. В клетках fin1Δ около 30% показали локализацию кинетохор Bub3, однако в мутантных клетках fin1Δ ipl1-321 и fin1Δ sli15-3 локализация кинетохор составляла только 8% и 7% соответственно (рис. 4B).Мы заметили, что частота локализации кинетохор Bub1 или Bub3 в этих клетках fin1Δ была ниже по сравнению с мутантами cdc15-2 . Мы считаем, что блокирование выхода из митоза в мутантных клетках cdc15-2 также может способствовать локализации кинетохор комплекса Bub1-Bub3, как описано выше. В любом случае данные предполагают, что активность Ipl1 предотвращает ассоциацию кинетохор Bub1 и Bub3 в анафазе. Это представление, по-видимому, противоречит тому факту, что Ipl1 локализуется на веретене во время анафазы.Вполне вероятно, что Ipl1 фосфорилирует некоторые белки кинетохор перед анафазой, но обращение этого фосфорилирования происходит в анафазе, что способствует удалению Bub1-Bub3 из кинетохоры.

Рис. 4. Активность Ipl1 необходима для локализации кинетохор Bub1-Bub3 в клетках fin1Δ во время анафазы.

(A) Кинетохорная локализация Bub1 в анафазных клетках с нарушенной активностью Ipl1. Клетки с указанными генотипами и маркерами Bub1-GFP Nuf2-mCherry (3196-1-3, 3445-3-2 и 3653-1-1) выращивали в YPD при 25°C до логарифмической фазы, а затем переводили на 37 °C в течение 180 минут для инактивации Sli15 и Ipl1.Клетки собирали и подсчитывали локализацию кинетохор Bub1 в клетках анафазы (n = 100). Белые стрелки указывают на локализацию кинетохор анафазы Bub1. Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. Масштабная линейка, 5 мкм. (B) Кинетохорная локализация Bub3 (3922-11-3) в анафазных клетках с нарушенной активностью Ipl1. Тот же метод использовали для изучения локализации кинетохор Bub3 у мутантов ipl1-321 (3922-2-3) и sli15-3 (3927-9-3).Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием однофакторного дисперсионного анализа Крускала-Уоллиса. Масштабная линейка, 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592.g004

Fin1-PP1 способствует дефосфорилированию белка кинетохор Ndc80 для диссоциации Bub1-Bub3 от кинетохоры в анафазе

В дрожжевых клетках киназа Ipl1 фосфорилирует кинетохорный белок Dam1, чтобы ослабить взаимодействие кинетохор-микротрубочки и сохранить активность SAC [10,40].Как только установлено правильное прикрепление хромосом, Dam1 дефосфорилируется с помощью PP1, чтобы стабилизировать прикрепление кинетохор и сделать возможным молчание SAC [9]. Поскольку Fin1-PP1 локализуется в кинетохоре после молчания SAC, Dam1 вряд ли является субстратом Fin1-PP1.

Ipl1 также фосфорилирует кинетохорный белок Ndc80, чтобы облегчить его взаимодействие с микротрубочками, и были идентифицированы сайты фосфорилирования Ipl1 в Ndc80 [41]. Данные по клеткам млекопитающих указывают на то, что Aurora B фосфорилирует Ndc80/Hec1, чтобы способствовать его связыванию с киназой SAC Mps1 [42].И в клетках дрожжей, и в клетках млекопитающих Mps1-зависимое фосфорилирование кинетохорного белка Spc105/Knl1 способствует связыванию кинетохор Bub1-Bub3 [4,43]. Возможно, что Fin1-PP1 дефосфорилирует Ndc80, чтобы регулировать кинетохорную ассоциацию Bub1-Bub3. Чтобы проверить эту идею, мы сравнили фосфорилирование Ndc80 в клетках WT и fin1Δ с использованием Phos-tag SDS-PAGE. Мы подготовили образцы белка из клеток в середине логарифмической фазы, и Ndc80 показал резкое разделение при SDS-PAGE Phos-tag. Мы заметили увеличение высокофосфорилированных видов Ndc80 в мутантных клетках fin1Δ (рис. 5А).Далее мы измерили кинетику фосфорилирования Ndc80 в синхронных клетках WT и fin1Δ . Клетки дикого типа показали явное снижение гиперфосфорилированных видов Ndc80 около входа в анафазу (75 мин) после высвобождения G ₁ при 25°C. Напротив, мутантных клеток fin1Δ демонстрировали постоянное появление гиперфосфорилированных видов Ndc80 на протяжении клеточного цикла. Отношение фосфорилированных полос к Pgk1 подтверждает это представление (Fig. 5B). Эти результаты показывают, что Fin1-PP1 способствует дефосфорилированию Ndc80.

Рис. 5. Fin1-PP1 способствует дефосфорилированию субстрата Ipl1 Ndc80 в анафазе.

(A) Анализ фосфорилирования Ndc80 в клетках WT (3802-1-4) и fin1Δ (3802-2-2) с использованием геля Phos-tag. Клетки WT и fin1Δ с Ndc80-13myc выращивали до логарифмической фазы в YPD при 30°C. Образцы белка собирали и разделяли на геле Phos-tag. Мембрану исследовали антителом против myc, чтобы показать разделение фосфорилированных видов Ndc80. Показанное изображение является репрезентативным для трех экспериментальных повторов и статистической значимости, определяемой как p <0.05 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. (B) В клетках fin1Δ наблюдается замедленное дефосфорилирование Ndc80. Клетки WT (3802-1-4) и fin1Δ (3802-2-2), содержащие Ndc80-13myc, арестовывали в G ₁ и затем высвобождали в YPD при 30°C. Клетки собирали каждые 15 минут для приготовления образцов белка и подсчета индекса почкования. Гель Phos-tag был использован для разделения белков и показал виды фосфорилированного белка Ndc80. Отношение фосфорилированных видов к контрольной нагрузке Pgk1 количественно определяли с использованием ImageJ для каждой временной точки и отображали в виде графика.Фотографии являются репрезентативными для трех экспериментальных повторов.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592.g005

Дефосфорилирование Ndc80 снижает локализацию кинетохор Bub1-Bub3 в анафазе

Если Fin1-PP1 способствует удалению белков SAC Bub1-Bub3 путем дефосфорилирования Ndc80, то мутант ndc80 с дефицитом фосфора, вероятно, уменьшит локализацию кинетохор анафазы Bub1-Bub3 в клетках fin1Δ . Семь консервативных сайтов Ipl1 (T21, S37, T54, T71, T74, S95 и S100) были идентифицированы в Ndc80, и замена этих сайтов аланином привела к образованию мутанта ndc80-7A [24].Для подтверждения сниженного фосфорилирования у мутанта ndc80-7A образцы белка готовили с использованием асинхронных штаммов ndc80Δ , покрытых либо NDC80-myc , либо ndc80-7A-myc плазмидами. После разделения с помощью геля Phos-tag наблюдалось явное снижение фосфорилирования белка Ndc80-7A (фиг. 6A). Мы также исследовали фосфорилирование Ndc80 в мутантных фонах ndc80Δ fin1Δ , покрытых плазмидами NDC80-myc или ndc80-7A-myc .Было обнаружено очень мало фосфорилированных видов белка Ndc80-7A в клетках fin1Δ (рис. 6A), что указывает на то, что сайты-мишени Fin1-PP1 мутированы в Ndc80-7A.

Рис. 6. Дефосфорилирование Ndc80 способствует диссоциации Bub1 от кинетохора во время анафазы.

(A) Сниженное фосфорилирование фосфодефицитных белков Ndc80-7A. Клетки fin1Δ ndc80Δ , несущие плазмиды WT NDC80-myc (3893-10-3) и дефицитные по фосфору ndc80-7A-myc (3897-5-3), выращивали до логарифмической фазы при 30°C.Образцы белков готовили из асинхронных клеток и запускали на геле Phos-tag. Вестерн-блоттинг исследовали антителом против myc, чтобы показать разделение фосфорилированных видов. (B) Локализация кинетохор Bub1 в клетках ndc80-7A во время анафазы. Клетки fin1Δ ndc80Δ cdc15-2 BUB1-GFP NUF2-mCherry , несущие плазмиды NDC80 (3975-5-3) или ndc80-7A (3941-1-4), выращивали до логарифмической фазы в YPD при 30° Затем Cd перешел на непермиссивную температуру 37° на 180 минут, чтобы инактивировать Cdc15.Взяли пробы и сделали фотографии. Подсчитывали клетки анафазы с совместной локализацией Bub1-кинетохор (n = 100). Белые стрелки указывают на совместную локализацию. Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. Масштабная линейка, 5 мкм. (C) Локализация кинетохор Bub3 в клетках ndc80-7A во время анафазы. Тот же протокол был использован для изучения локализации кинетохор Bub3 (3893-9-2 и 4057-26-1).Эксперимент повторяли три раза, и статистическую значимость определяли как p <0,05 с использованием критерия суммы рангов Уилкоксона. Масштабная линейка, 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1009592.g006

Чтобы определить, зависит ли локализация кинетохор Bub1 и Bub3 в анафазе от фосфорилирования Ndc80, мы использовали cdc15- 2 fin1Δ ndc80Δ NDC80-myc или ndc80-7A-myc . Клетки выращивали до логарифмической фазы при 25°С, а затем переводили на непермиссивную температуру 37°С на 3 часа для задержания клеток в телофазе.Были изучены сигналы Bub1-GFP и Nuf2-mCherry, и мы обнаружили, что Bub1 локализуется на кинетохоре в 47% клеток, покрытых NDC80 , в то время как анафазная локализация кинетохор Bub1 была обнаружена в 22% клеток, покрытых ndc80-7A . (рис. 6В). Аналогичные результаты справедливы для Bub3; 55% клеток с NDC80 показали локализацию кинетохор анафазы Bub3-GFP, но только 19% клеток, покрытых ndc80-7A , показали локализацию кинетохор Bub3 (рис. 6C).Стоит отметить, что клетки cdc15-2 ndc80Δ , покрытые плазмидами NDC80-myc , демонстрируют пониженную локализацию кинетохор в анафазе Bub1 и Bub3 по сравнению с клетками cdc15- 2 (рис. 2). Одна возможность состоит в том, что myc-tag на С-конце Ndc80 ставит под угрозу его функцию. Мы также признаем, что локализация кинетохор Bub1 и Bub3 не полностью устранена в клетках ndc80-7A , что указывает на то, что Fin1-PP1 может также дефосфорилировать другие сайты в Ndc80 или других субстратах, таких как Bub1, для диссоциации кинетохор Bub1- Буб3.Несмотря на это, уменьшенная локализация кинетохор Bub1 и Bub3 в анафазе в клетках, экспрессирующих ndc80-7A , предполагает, что дефосфорилирование Ndc80 способствует удалению Bub1 и Bub3 из кинетохор во время анафазы.

fin1Δ демонстрируют стойкое фосфорилирование Ndc80 и локализацию Bub1-Bub3 в кинетохоре. Это может быть результатом задержки киназы Mps1 в кинетохоре. Чтобы проверить это, мы провели анализ кинетохорной иммунопреципитации в клетках cdc15-2 и cdc15-2 fin1Δ , экспрессирующих Dsn1-FLAG и Mps1-13myc, как описано ранее [44].Не было обнаружено усиления взаимодействия Mps1 с кинетохорным белком Dsn1 в клетках cdc15-2 fin1Δ по сравнению с клетками cdc15-2 (рис. S6). Кроме того, мы исследовали, зависит ли локализация кинетохор Bub1-GFP в анафазе в клетках fin1Δ от активности Mps1 с использованием чувствительного к температуре мутанта mps1-1 . Интересно, что мы обнаружили, что совместная локализация Bub1 с кинетохорой в клетках mps1-1 fin1Δ была значительно снижена по сравнению с клетками fin1Δ (рис. S7).В совокупности эти результаты предполагают, что локализация кинетохор Bub1 в анафазе в клетках fin1Δ зависит от активности Mps1. Мы предполагаем, что дефосфорилирование Ndc80 с помощью Fin1-PP1 может подавлять активность Mps1 или активировать дефосфорилирование субстратов Mps1, чтобы облегчить удаление Bub1-Bub3 из кинетохор, но это маловероятно происходит из-за локализации Mps1 в кинетохорах.

Фосфодефицитные мутанты

Преждевременная локализация Fin1-PP1 на кинетохорах вызывает потерю жизнеспособности клеток с индуцированным синтетическим прикреплением [19].Мы пришли к выводу, что несвоевременное дефосфорилирование Ndc80 с помощью Fin1-PP1 может иметь сходный фенотип в ответ на синтетическое присоединение. Ранее мы показали, что сверхэкспрессия спирально-скрученного домена моторного белка Cik1 ( CIK1-CC) индуцирует синтетические присоединения [7]. Действительно, дефицитные по фосфору мутанты ndc80-7A плохо росли на чашках с галактозой, где CIK1-CC сверхэкспрессируется, чтобы индуцировать синтетическое присоединение (фиг. 7A). Кроме того, клетки ndc80-7A продемонстрировали значительную потерю жизнеспособности после сверхэкспрессии CIK1-CC .Только 33% из мутантов ndc80-7A были жизнеспособны после сверхэкспрессии CIK1-CC в течение 6 часов, тогда как 77% клеток WT были жизнеспособны в тех же условиях (фиг. 7B).

Рис. 7. Фосфодефицитный мутант ndc80-7A чувствителен к индукции прикрепления синтетических хромосом.

(A) ndc80-7A мутантные клетки чувствительны к сверхэкспрессии CIK1-CC . Клетки NDC80 (SBY7258) и ndc80-7A (SBY7259), несущие вектор (V, pRS416) или P _GAL CIK1-CC

, плазма 10Wid, 00, pYid кратно серийно разводили и высевали на планшеты с глюкозой и галактозой.Планшеты инкубировали при 30°С в течение 2 дней перед сканированием. (B) Те же штаммы выращивали до логарифмической фазы на среде с рафинозой, затем добавляли галактозу до конечной концентрации 2%. Клетки собирали каждые 2 часа и распределяли по чашкам YPD. Планшеты выращивали при 30°C в течение ночи для эффективности посева (n ≥ 300). (C) fin1Δ мутант не подавляет чувствительность клеток ndc80-7A к сверхэкспрессии CIK1-CC . ndc80-7A (3932-5-1) и fin1Δ ndc80-7A (3932-3-1) клетки, несущие вектор (V, pRS416) или P _GAL